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2018 年度 実施状況報告書

光受容体タンパク質が自発的に作る2次元秩序構造についての構成的研究

研究課題

研究課題/領域番号 17KT0024
研究機関神戸大学

研究代表者

森垣 憲一  神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)

研究分担者 林 文夫  神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
山下 隼人  大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (10595440)
粟津 暁紀  広島大学, 理学研究科, 准教授 (00448234)
研究期間 (年度) 2017-07-18 – 2020-03-31
キーワード光シグナル伝達 / ロドプシン / ラフト / 擬結晶 / GPCR
研究実績の概要

本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。これまでの研究から、ラフト領域(秩序液晶相:lo相)と非ラフト領域(無秩序液晶相:ld相)をパターン化した人工膜を開発し、Rhの脂質ラフトへの親和性をlo/ ld相への分配から定量的に評価することに成功した。この技術を発展させ、ラフト領域の脂質組成やRh濃度を調節することで、人工膜にRh超分子クラスターなどの2次元秩序構造を再構成する。平成30年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する技術開発を行った。①パターン化人工膜作製では、ガラス基板に流動性脂質膜(100%生体脂質)と部分重合膜(生体脂質とポリマー脂質の混合膜)を持つパターン化膜を作製し、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製した。
②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))の再構成を行いラフト・非ラフト領域の分配を定量した。③Rh超分子クラスターの形成は、円板膜より再構成した膜を高速AFMで観察し、完全暗黒下でRhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の観察に成功した。④数理モデルの構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現してロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量し、クラスター形成を評価した。以上の研究成果により、円板膜におけるロドプシン光受容体の2次元秩序構造が光シグナル伝達に果たす役割について、知見を得ることができた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。平成30年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する基盤技術の開発を行うことができた。①パターン化人工膜の作製では、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製して、光シグナル伝達に関わる分子群のラフト親和性を定量した。②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))を機能を保持した形で再構成する技術を開発した。③Rh超分子クラスターの形成では、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体を完全暗黒下で高速AFMで観察することに成功し、Rhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察した。④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現し、ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量してクラスター形成を評価した。以上の結果は、視細胞円板膜の2次元秩序を人工膜に再構成し、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションで詳細に解析することで、自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な基盤となる。

今後の研究の推進方策

平成31年度は、以下の検討を行うことで、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する技術を開発したい。
①パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成:2次元秩序構造形成にはRh二量体が重要であると考えられるため、導入条件(界面活性剤濃度、希釈率、攪拌、脂質組成など)を改善することで、Rhを二量体形成に必要な密度(およそ100分子/平方マイクロメートル以上)で再構成することを試みる。Rh拡散、二量体形成を観測して導入条件を最適化する。
②Rh超分子クラスターの形成:超分子クラスターの動的形成過程、分子集合状態、二量体、オリゴマーとの平衡を、1分子蛍光観察および高速AFMを用いて詳細に観察する。
③Rh超分子クラスターの機能解析:高速AFMを用いてRh超分子クラスターを暗中で観察しながらRh分子を光活性化し、Rh分子の構造と集合状態の変化を調べる。暗室中で、Rhのみ、Gt添加、光照射、GTP添加、の条件で分子解像度の観察像を得ることを目指す。
④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルの構築:平成29年度に引き続き、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現する。Rh 凝集状態(単量体~多量体)に応じてラフト、非ラフト脂質への親和性が変化する、Rh凝集体の解離定数が周辺の脂質組成によって影響されると仮定して、これらの寄与の重みを変えつつシミュレーションを行い、Rh超分子クラスター形成を考察する。

次年度使用額が生じた理由

平成30年度は、高速AFM観察を完全暗黒下で行う暗室整備などのために実験量が若干制限され、一方、平成31年度には蛍光1分子観察、高速AFM観察、シミュレーションを統合するためにより多くの実験を必要と予想されるために、次年度使用額が生じました。

  • 研究成果

    (23件)

すべて 2019 2018 その他

すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件) 学会発表 (14件) (うち国際学会 5件、 招待講演 10件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Insulator Activities of Nucleosome-Excluding DNA Sequences without Bound Chromatin Looping Proteins2019

    • 著者名/発表者名
      Matsushima Yuki、Sakamoto Naoaki、Awazu Akinori
    • 雑誌名

      The Journal of Physical Chemistry B

      巻: 123 ページ: 1035~1043

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.8b10518

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Torsional Turning Motion of Chromosomes as an Accelerating Force to Align Homologous Chromosomes during Meiosis2019

    • 著者名/発表者名
      Takao Kazutaka、Takamiya Kazunori、Ding Da-Qiao、Haraguchi Tokuko、Hiraoka Yasushi、Nishimori Hiraku、Awazu Akinori
    • 雑誌名

      Journal of the Physical Society of Japan

      巻: 88 ページ: 023801~023801

    • DOI

      10.7566/JPSJ.88.023801

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Evolution and development of model membranes for physicochemical and functional studies of the membrane lateral heterogeneity2018

    • 著者名/発表者名
      Morigaki Kenichi、Tanimoto Yasushi
    • 雑誌名

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes

      巻: 1860 ページ: 2012~2017

    • DOI

      10.1016/j.bbamem.2018.03.010

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Nanofluidic Biosensor Created by Bonding Patterned Model Cell Membrane and Silicone Elastomer with Silica Nanoparticles2018

    • 著者名/発表者名
      Tanabe Masashi、Ando Koji、Komatsu Ryota、Morigaki Kenichi
    • 雑誌名

      Small

      巻: 14 ページ: 1802804~1802804

    • DOI

      10.1002/smll.201802804

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Control of surface potential and hydroxyapatite formation on TiO 2 scales containing nitrogen-related defects2018

    • 著者名/発表者名
      Hashimoto Masami、Ogawa Takafumi、Kitaoka Satoshi、Muto Shunsuke、Furuya Maiko、Kanetaka Hiroyasu、Abe Masayuki、Yamashita Hayato
    • 雑誌名

      Acta Materialia

      巻: 155 ページ: 379~385

    • DOI

      10.1016/j.actamat.2018.05.072

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Bifacial Nucleobases for Hexaplex Formation in Aqueous Solution2018

    • 著者名/発表者名
      Kashida Hiromu、Hattori Yuhei、Tazoe Kaho、Inoue Tadashi、Nishikawa Keiji、Ishii Kentaro、Uchiyama Susumu、Yamashita Hayato、Abe Masayuki、Kamiya Yukiko、Asanuma Hiroyuki
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 140 ページ: 8456~8462

    • DOI

      10.1021/jacs.8b02807

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Broad distribution spectrum from Gaussian to power law appears in stochastic variations in RNA-seq data2018

    • 著者名/発表者名
      Awazu Akinori、Tanabe Takahiro、Kamitani Mari、Tezuka Ayumi、Nagano Atsushi J.
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 1-8

    • DOI

      10.1038/s41598-018-26735-4

    • 査読あり
  • [学会発表] 生体分子のインクジェット塗布におけるトレハロースの効果2019

    • 著者名/発表者名
      森垣憲一
    • 学会等名
      第22回トレハロースシンポジウム
    • 招待講演
  • [学会発表] Model biological membrane on the solid substrate: Potentials for biophysical studies and biomedical applications2019

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki
    • 学会等名
      Biochemistry and Cell & Developmental Biology Seminar Series at Weill Cornell Medicine
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Self-spreading of a phospholipid bilayer in the scaffold of polymerized lipid bilayer2019

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki, Fuyuko Tamura, Yasushi Tanimoto, Rurika Nagai, Misato Yamada, Fumio Hayashi
    • 学会等名
      257th ACS National Meeting and Exposition
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 生細胞膜分子動態を観る極限時空間分解能AFMの創成2019

    • 著者名/発表者名
      山下隼人
    • 学会等名
      日本化学会第99春季年会(2019)コラボレイション企画
    • 招待講演
  • [学会発表] 生体分子のナノ動態を可視化する高速原子間力顕微鏡2019

    • 著者名/発表者名
      山下隼人
    • 学会等名
      ナノ技術応用分科会講演会
    • 招待講演
  • [学会発表] 網膜桿体細胞内円盤膜上での脂質-光受容タンパク質秩序形成の数理モデル2019

    • 著者名/発表者名
      金重 先人, 谷本 泰士, 西森 拓, 林 文夫, 森垣 憲一, 粟津 暁紀
    • 学会等名
      日本物理学会 2019春季大会
  • [学会発表] Patterned model membrane on the solid substrate2018

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki
    • 学会等名
      Bioelectrochemistry and more…2018, AIT/CEST Workshop
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Reconstituting Membrane Proteins in a Patterned Model Membrane2018

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki
    • 学会等名
      Workshop on Proteins in Artificial Membranes
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Raftophilicity and aggregation of membrane proteins in the photo-transduction2018

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki, Yasushi Tanimoto, Hayato Yamashita, Akinori Awazu, Fumio Hayashi
    • 学会等名
      日本生物物理学会第56回年会
    • 招待講演
  • [学会発表] 人工生体膜とナノ空間を用いた生体分子計測技術の開発2018

    • 著者名/発表者名
      森垣憲一
    • 学会等名
      量子ビームによるナノ構造形成とその医療・バイオ応用技術調査専門委員会
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of complex and functional model membranes on solid substrate2018

    • 著者名/発表者名
      Kenichi Morigaki
    • 学会等名
      International Symposium on Science and Technology of Molecular Assemblies for Biomaterials Innovation
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Observing the interaction between rhodopsin cluster and transducin by high-speed AFM2018

    • 著者名/発表者名
      Y. Tanimoto, H. Yamashita, K. Nomura, M. Abe, F. Hayashi, K. Morigaki
    • 学会等名
      日本生物物理学会第56回年会
  • [学会発表] A mathematical model of pattern formation of lipid-photoreceptor protein on disk membrane o retinal cells2018

    • 著者名/発表者名
      金重 先人, 谷本 泰士, 西森 拓, 林 文夫, 森垣 憲一, 粟津 暁紀
    • 学会等名
      日本生物物理学会第56回年会
  • [学会発表] 網膜桿体細胞内円盤膜上での脂質-光受容タンパク質秩序形成の数理モデル2018

    • 著者名/発表者名
      金重 先人, 谷本 泰士, 西森 拓, 林 文夫, 森垣 憲一, 粟津 暁紀
    • 学会等名
      定量生物学会
  • [備考] 神戸大学バイオシグナル総合研究センター環境物質応答部門

    • URL

      http://www.research.kobe-u.ac.jp/rceg-nowstone/index.html

  • [備考] 神戸大学(森垣憲一)

    • URL

      http://www2.kobe-u.ac.jp/~morigaki/

URL: 

公開日: 2019-12-27  

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