| 研究課題/領域番号 |
17KT0049
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
|
|---|
| 研究分担者 |
越智 陽城 山形大学, 医学部, 准教授 (00505787)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-07-18 – 2020-03-31
|
| キーワード | 発ガンドライバー遺伝子 / CRISPR-Cas9 / ネッタイツメガエル / 腫瘍化 |
|---|
| 研究実績の概要 |
平成29年度は、CRISPR-Cas9の実験系において、転写を介さないgRNAがネッタイツメガエル胚においても確実に作用するかどうかの検証実験を行った。そのため、これまでにCRISPR-Cas9での破壊実績のあるチロシナーゼを検討した。この検証にあたっては、これまではチロシナーゼに対するgRNAは、プラスミドに連結した遺伝子のinvitro転写によって合成することが一般的であったが、今年度の本格的な実験の遂行にあたっては、RNAの外注が効率的であるため、そのまま外注RNAを使う系を使用した。その結果、crRNAとtracerRNAをアニーリングし、Cas9タンパク質を混和させるだけで、効率的なチロシナーゼの破壊、すなわち表皮の白色化を確認することができた。次に、がん抑制遺伝子として知られているAPCの破壊を行った。その結果、APC gRNAのインジェクションによるAPC単独の破壊によっても、腫瘍を持つ個体を得ることができている。本研究そのものがマルチヒット仮説を前提としているため、恐らく他の遺伝子の協調的破壊によって腫瘍化の効率が上がることが期待される。この結果を足場に、新たなガイドRNA（2５種類を予定）を作成し、平成30年度に本格的なスクリーニングを開始する予定であるが、この準備のためガイドRNAの設計（特にoff-targetを避けるため）を行い、現在までに配列の設計については終了している。更に、研究代表者の研究室で必ずしもきちんと稼働していなかったネッタイツメガエルの系について、インジェクション実験をするための準備を行い、来年度に向けた本格的な稼働が可能な状態にした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定に比べて若干の遅れはあるが、研究代表者がネッタイツメガエルの実験系を導入して遂行可能な状況になったこと、分担研究者によりAPCインジェクションによる腫瘍化が確認できたことなどから、２９年度の約半年間で行うべき最低限の実験結果は予定通り出たと同時に、３０年度以降の本格的な実験遂行の足固めもできたと考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成３０年度は、本研究課題を主たる研究テーマに据えた大学院生が参画したこともあり、本格的に研究を展開していきたい。まずは設計済みのｇRNAを得た上で、早速ネッタイツメガエル胚に微量注入して初期幼生を２週間培養し、腫瘍を持つ個体を順次スクリーニングしていく。まずは１万個体ほどのスクリーニングを目指す。昨年度までの結果により、数十個体の腫瘍化個体が得られる見通しなので、ある程度の数が集まったところで提案書の通り、バーコードシーケンスを行うための準備を行う。提案書では１細胞シーケンスを予定していたが、腫瘍の大きさがある程度あるようならば、drop-seqではなく通常のDNA単離を腫瘍ごとに行い、バーコード付加をした後にまとめて次世代シーケンス解析を行う。上記のインジェクションースクリーニングは作業の効率化を図るため、代表機関である東京大、分担期間である山形大で同時平行で行う。３０年度下半期において、研究の進展度合いを見ながら、次の遺伝子ペア（２５遺伝子）についてもｇRNAの購入、インジェクション、腫瘍保持個体のスクリーニングへと進んでいく予定である。なお、当初の計画には無かったが、必要に応じて広島大両生類研究センターの共同実験施設も活用することで、研究進捗の更なる促進を図ることも視野に入れておく。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に設計が終わらなかったｇRNAの発注費を次年度に回したい。また、申請書にて計画したスクリーニングした腫瘍DNAシーケンスも次年度に行うこととなった。更には、人件費を計上した技術員雇用が、適任者がいなかったため出来なかったことから、次年度使用額が生じた。
|
