| 研究概要 |
TGF-βは上皮細胞に対して増殖抑制に作用するが,多くのがん細胞ではTGF-β刺激に不応性であることからそのシグナル伝達経路に何らかの異常が存在すると推定されている.しかし,過半数の癌ではTGF-β刺激に対して不応となる機序は不明であり.未知のシグナル伝達分子が想定されている.申請者らはこれまでTGF-βのシグナル伝達機構において癌抑制遺伝子p53が重要な役割を担っていることを見い出し報告してきた.即ち,1)変異型P53発現株やEIBでP53を不活化した細胞株ではTGF-β感受性が喪失していること,2)また逆に,P53欠損株であるKATOIII細胞に,tet-on/off systemで野生型P53を発現させるとP53発現時にのみTGF-β感受性がみられたこと,3)TGF-β感受性株で野生型P53発現株であるMCF7では,siRNA導入によりp53をknock downするとTGF-βによる増殖抑制が解除される結果を得,p53がTGF-βのsignal acceptorであることを証明した.また更には,4)TGF-β receptor(TβR)にrecruitされたprotein phosphatase 2A(PP2A)のBα subunitが,TβRのserine/threonine kinaseによりリン酸化/活性化され,p53のセリン376の脱リン酸化を惹起しp53の核移行を促進して細胞周期停止シグナルを伝達していることをを見い出している.以上の結果より,TGF-βによる増殖抑制シグナルからの逸脱を生じる原因として,癌において高頻度に認められるp53の変異・欠損も関与していると推察される.しかし,このTGFβ-PP2A-p53シグナルにおいてkey moleculeであるPP2A-Bαの癌における異常は報告されていない.平成18年度ではin vitroの系として,PP2A-Bαの変異欠損の有無を樹立細胞株を用いて探索し,癌との関係について基礎的検討を行うこと,invivoの系としては既に得られているPP2A-Bα KDマウスのF2,F3系統の表現型を解析した後,Smad4+/-マウスと交配し,Smad4/Bα double knockoutマウスを作成することを目指した.なお,Smad4-/-マウスは胎生致死であるため(Takaku K. et al.,Cell,92,1998;Takaku K et al.,Cancer Res,1999),Smad4+/-マウスとPP2A-Bα KDマウスとの交配を進める。PP2A-Bαの癌における変異・欠損1)既に,リンパ腫の樹立細胞株において蛋白レベルでPP2A-Bαの欠損,低発現株をそれぞれ1株ずつ見出しているので,この細胞株におけるmRNAの発現をnorthern blot, RT-PCRで確認しTGF-βに対する感受性を検討した.2)当教室で保有する他の種々の樹立細胞株(大腸癌10株,胃癌12株,白血病細胞10株,膵癌6株,骨肉腫3株,他4株)のPP2A-Bαの発現をwestern blotで確認し,RT-PCRでmRNAの発現を確認すると同時にTA cloningを行いDNA sequenceで変異の有無を検討した結果,リンパ腫細胞株において発現の低下を認めた.また,NIH3T3/PP2A-Bα Knock down細胞(NIH3T3-BαKD)を樹立し,TGF-βの感受性を検討した,
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