超好熱菌を宿主とした遺伝子発現系の構築

2007 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18018026
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 跡見 晴幸 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90243047)
• キーワード: 超好熱菌 / アーケア / 遺伝子破壊 / 遺伝子発現 / 遺伝子導入 / プロモーター / マーカー遺伝子 / Thermococcus

研究概要

我々は以前にTK1761が耐熱性β-glycosidaseをコードすることを明らかにした。本β-glycosidaseの基質特異性がp-nitro-pheny1 (pNp)-β-D-glucopyranoside≒pNp-β-D-mannopyranoside>pNp-β-D-galactopyranosideであることが分かった。本研究ではTK1761のreporter遺伝子としての利用を検討した。T. kodakaraensisの無細胞抽出液にはクロマトグラフィーで分離可能な2種のβ-glycosidase活性が存在することが分かった。そこでこれら2種の基質特異性を検討した結果、片方はortho-nitropheny1-β-D-glucopyranoside (ONPgluco)およびortho-nitropheny1-β-D-mannopyranoside (ONPmanno)を加水分解する活性を示したが、ortho-nitropheny1-β-D-galactopyranoside (ONPgalacto)を認識しないことが判明した。もう一方の酵素はONPgalacto分解活性を示した。TK1761遺伝子を高発現したところ、無細胞抽出液中のONPglucoおよびONPmanno分解活性は顕著に増加したが、ONPgalacto分解活性は宿主細胞のKW128株と同程度であった。したがってONPglucoおよびONPmanno分解活性を測定することにより、TK1761はreporter遺伝子として利用できることが示された。さらにTK1761を利用して始原菌において転写と翻訳が実際並行して起こること(polarity)を初めて証明した。これは遺伝子の発現制御の観点から非常に重要な結果であり、これにより始原菌においても翻訳段階での転写調節が起こり得ることを示唆するものである。さらに薬剤耐性に基づいた遺伝子破壊系を他の超好熱菌に適用し、Thermococcus litoralisでもこの系が利用可能であることが判明した。

研究成果

• [雑誌論文] Polarity in archaeal operon transcription in Thermococcus kodakaraensis (2008)
  • 著者名/発表者名: Santangelo T, Cubonova L, Matsumi R, Atomi H, Imanaka T, Reeve JN
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 190 ページ: 2244-2248
  • 査読あり
• [雑誌論文] A global transcriptional regulator in Thermococcus kodakaraensis controls the expression levels of both glycolytic and gluconeogenic enzyme-encoding genes (2007)
  • 著者名/発表者名: Kanai T, Akerboom J, Takedomi S, van de Werken HJ, Blombach F, vander Oost J, Murakami T, Atomi H, Imanaka T
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 282 ページ: 33659-33670
  • 査読あり
• [雑誌論文] Methionine sulfoxide reductase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis, an enzyme designed to function at suboptimal growth temperatures (2007)
  • 著者名/発表者名: Fukushima E, Shinka Y, Fukui T, Atomi H, Imanaka T
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 189 ページ: 7134-7144
  • 査読あり
• [学会発表] Unusual pentose metabolism in Thermococcus kodakaraensis (2007)
  • 著者名/発表者名: 跡見晴幸
  • 学会等名: Gordon Research Conferences(招待講演)
  • 発表場所: Proctor Academy, NH, USA
  • 年月日: 2007-08-20