研究課題
[1]コウジ菌由来アポ型チロシナーゼの精製プロセスの確立コウジ菌由来のチロシナーゼ遺伝子mel B(C末端にHis-tagを導入したもの)を大腸菌に組み込み(形質転換し)、大量培養を行った。このとき、出来るだけ多くのチロシナーゼが得られるように、培地や培養条件の最適化を行った。次に大腸菌の細胞を破砕しCell-free抽出液とした後、ニッケルカラムとイオン交換カラムを用いて精製した。蛋白質の精製はSDSページで確認した。[2]アポ型チロシナーゼの銅イオンによる再構成とトリプシンによる活性化精製したアポ型チロシナーゼに銅(II)イオンを添加してホロ型チロシナーゼを調製した。ホロ型チロシナーゼの生成は、酵素活性(フェノラーゼ活性およびカテコラーゼ活性)の測定や原子吸光法を用いて確認した。さらにホロ型チロシナーゼに加水分解酵素であるトリプシンを作用させることにより、酵素活性が劇的に向上することを見いだした。次にトリプシン処理の効果を調べるために、各ペプチド断片のアミノ酸配列を調べ、活性型チロシナーゼの構造について考察を加えた。[3]他の遷移金属を用いたチロシナーゼのホロ化の試み精製したアポ型チロシナーゼに銅(II)イオン以外の遷移金属(鉄、コバルト、ニッケル、マンガンなど)を加え、酸化活性を比較した。しかし、現在のところ銅チロシナーゼの活性を超えるものは見つかっていない。
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