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本研究は、シグナル伝達系を試験管内で再構成し、その速度論的な性質を明らかにすることを目的とする。具体的には、蛍光相関分光法でシグナル伝達系における相互作用反応を測定し、さらに複数の相互作用段階からなる一連の系路を試験管内で再構成し、その系路の各部分や全体での速度論的パラメーターを測定することを目標として解析を行った。解析対象には、最も詳細に解析がなされているシグナル伝達系であるTNFシグナル伝達系を用い、その構成要素の相互作用によって下流へのシグナル伝達が行われる過程を試験管内で再構成するために、これらの構成要素の組換えタンパク質発現を行った。蛍光相関分光法で相互作用解析を行うためには、タンパク質の機能・構造に影響を及ぼさない部位に低分子蛍光分子を標識する必要がある。このため、申請者はN末端への部位特異的蛍光修飾を行うために、N末端にセリンを有する組換えタンパク質発現を行うための発現ベクターを構築し、N末端セリンの酸化とヒドラジン化した蛍光分子の重合による、タンパク質のN末端部位特異的標識を行った。また、この方法で蛍光標識した組換えタンパク質を未標識タンパク質や未反応蛍光分子から分離・精製するための条件を検討し、HPLCによって分離・精製する方法を確立し、この組換え型リガンドの受容体との結合を蛍光相関分光法で測定した。この結果、部位特異的標識が行われていることは確認できたが、受容体との結合が非常に低濃度で起こるため、蛍光相関分光法での測定が困難であるという課題が明らかになった。また受容体の組換えタンパク質発現系を検討したが、ショウジョウバエ細胞株S2発現系が、他の発現系よりも適しているものの、目的のタンパク質を大量に発現することは困難であった。これらの結果から、さらに発現系の改良、相互作用解析系の検討が必要であると考えられ、今後はこれらの点を検討してゆく予定である。
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