研究課題
大腸菌染色体の複製開始反応は、複製開始蛋白質DnaA のAIP結合型(活性型)とADP結合型(不活性型)とのバランスによって、オン・オフが切り替わる。この活性調節は細胞周期と共役しており、複製開始時期にATP-DnaAが蓄積し、複製開始後ADP-DnaAが産生する。ADP-DnaAはRIDAという複製伸長反応と共役したDnaA結合性AIP加水分解機構によっての産生する(不活性化システム)。AIP-DnaAは、特異的なDNA配列DARSがDnaA結合性ADPを解離し、そのATP再結合を促すことによって蓄積することが示唆されている(再活性化システム)。そこで本研究では、開始のオン・オフによりコントロールされた複製サイクル系の再構成を目指すべく、これら不活性化システムと再活性化システムの試験管内再構成系を確立した。また、これらの再構成系を用いた解析から、不活性化・再活性化それぞれについて、その発動を制御する新規因子の存在を示唆する結果を得た。1,DnaA不活性化システム(RIDA)【代表者】(1)これまで精製が困難であったDnaA不活性化因子Hdaについて、簡便な方法で高活性の標品を得る精製法を新たに構築した。(2)RIDA反応には複製装置の構成成分であるスライディングクランプのDNA装着が必要である。このDNA装着型クランプをゲル濾過により単離し、Hda存在下、ATP-DnaAと反応させることによりDnaA不活性化反応を行うことに成功した。(RIDA試験管内再構成系)(3)RIDA試験管内醐成の鮒から、DnaA不活性化反応がHdaのヌクレオチド結合によって制御されることを見出した。2,DnaA再活性化システム(DARS)【分担者】(1)DARSを高濃度AIP存在下、ADP-DnaAと反応させることでAIP-DnaAが産生する(DARSシステム)。このDARSシステムを試験管内ミニ染色体複製系に融合することにより、ADP-DnaAの複製開始活性の再生を検出することに成功した。(2)細胞抽出液中にDARSのDnaA再活性化活性を促進する活性を見出した。
すべて 2006
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