| 研究概要 |
本研究は,ディッシュに培養した細胞を顕微鏡下で観察しながら,タンパク質分解酵素を用いずにターゲットの細胞のみを回収する技術の開発を目的としたものである.この方法では,下限臨界共溶温度(約33℃)以下で水溶性を示す温度応答性化合物をコーティングしたディッシュに細胞を培養し,ターゲット細胞の直下の狭い領域のみを冷却して,脱着した細胞をマイクロピペットで吸引する.本年度の結果は以下のとおりである.
1.本方法を実現するために,顕微鏡の視野を遮らず,しかも20倍の対物レンズの動作距離の範囲内でディッシュの底面を局所的に冷却するデバイスを開発した.
2.良好な温度応答性を示すPNIPAAmと細胞接着性を有するPNIPAAmゼラチンの混合物をカバーガラスにスピンコーティングし,種々の混合比や濃度および回転速度に対して細胞の接着性能と冷却による脱着性能を評価して最適なスピンコーティング条件を見出した.そして,カバーガラスの縁に枠を取り付けて細胞の接着性が良く,かつ表面の温度低下により速やかに細胞が脱着するディッシュを作製した.
3.冷却によるディッシュ底面の温度変化と温度分布を測定し,冷却開始2秒後には下限臨界共溶温度以下に冷却が可能であることを確認するとともに,冷却効果がおよぶ範囲と冷却時間との関係を明らかにした.
4.マウス線維芽細胞3T3を細胞密度4000個/cm^2で上記のディッシュに播種し,18時間培養した後,細胞の回収実験を行った.その結果,1つの細胞にっき10秒程度で回収可能なことが明らかになった.また,1つのディッシュの複数個所からの選別回収や,相互に接着した細胞の回収にも成功した.
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