| 研究課題/領域番号 |
18050037
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
今本 尚子 理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 主任研究員 (20202145)
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| 研究分担者 |
前島 一博 独立行政法人理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 専任研究員 (00392118)
船越 智子 独立行政法人理化学研究所, 今本細胞核機能研究室, 協力研究員 (90318460)
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| キーワード | 核膜孔複合体 / イメージング / Photobleach / 細胞周期 / 膜貫通型タンパク質 / 走査電子顕微鏡 / 形成前駆体構造 / 核膜孔複合体構成因子 |
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| 研究概要 |
核膜孔複合体は、数個のサブコンプレックスから形成されることが近年明らかになっている。このため、各サブコンプレックスに含まれる代表的な蛋白質に蛍光タグを付け、HeLa細胞内で発現させて安定発現株を作製した。これらの安定発現株では核膜孔がラベルされ、そのダイナミクスをライブ観察することが可能となった。とりわけ、複合体の中で最も安定に存在するNUP133-YFPの発現株では、488nmレーザーをもちいて核膜表面のある核膜孔領域をbleachすることができ、新たに形成された核膜孔を可視化できるようになった。この手法と細胞周期の阻害剤を組み合わせることによって、間期の核膜孔形成が、細胞周期によって厳密にコントロールされていることが示された。また、走査電顕観察では、増殖期細胞において、核膜孔の形成過程らしき前駆体構造を捉えることに成功した。このような前駆体は脳のプリキンエ細胞など、分化細胞では観察されなかった(以上投稿準備中)。また、膜貫通型の核膜孔複合体構成因子であるPom121のヒト遺伝子座を詳細に解析した結果、ヒトには2つの全長Pom121がコードされていること、その2つの遺伝子からmRNAが共に読まれて、両者から、わずかにアミノ酸配列の異なるタンパク質が同じHeLa細胞内で発現していることを質量分析で確認した。この2つのPom121に蛍光をタグをつけた安定発現株を得て、発現タンパク質を指標に、それぞれの遺伝子に特異的に作用する複数のRNAオリゴを作用させた。その結果、2つのPom121を効率よくノックダウンしたときにのみ、核膜孔全体が消失することを確認した。このことは、Pom121が核膜孔複合体形成に必須の役割を果たすことを示している。この結果は、これまでに報告されていたPom121の、複合体構築における相反する機能に対して、1つの決着をつけたものとなった。
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