| 研究概要 |
開口放出は,生理活性物質の放出,受容体や輸送体などの細胞表面への呈示,さらには細胞の形態変化に伴う膜の供給に関わる重要な生命現象であり,積荷を載せた小胞が細胞膜と融合することにより起きる.膜融合反応は,Rabを初めとする特定の低分子量GTPaseとエフェクターとの相互作用によってGTP依存的に制御されている.本研究では,開口放出で働く繋留因子Exocyst複合体と,そこに相互作用する低分子量GTPaseとの複合体の立体構造解析を行ない,繋留の物理的機構およびその制御機構の構造基盤を確立することを目的とした.我々は,これまで電子顕微鏡およびX線結晶構造解析に向けて,Exocyst複合体をブタ脳から精製する方法を検討してきた.複合体が規則的なクラスターを形成する傾向は溶液中のMg^<2+>濃度を高めることにより改善があったが,粒子の大きさのばらつきを完全に無くすことはできなかった.また,Sec8サブユニットのC末端ペプチドに対する抗体が結合した状態の観察では,結合像を観察できたものの,粒子の均一性の悪さのため粒子の配向を決定するには至らなかった.このような現状ではあるが,酢酸ウラニルによる負染色の影響を受けている可能性も考えられるため,極低温電子顕微鏡による氷包埋像の観察あるいは結晶化も視野に入れて,より大量に精製する方法を検討したい.一方,ブタ脳からの精製と並行して,昆虫細胞Sf9とバキュロウイルスをつかった発現系によるExocyst複合体(あるいはサブ複合体)の再構成の試みを続けてきた.全てのサブユニットの発現系を構築するには至っていないが,Sec5,Sec6,Sec8についてはウイルスの調製を終えており,Exo70,Exo84についてはpFastBacへの組み込みを終えている.
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