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クローバ葉脈黄化ウイルス(CIYVV)がマメ科作物に引き起こす致死性のえそ病徴にCIYVVがコードするHC-Pro遺伝子のジーンサイレンシング抑制能が必要なことが昨年の研究で示唆された。そこで逆に、宿主植物側のサイレンシングを担う遺伝子もえそ病徴発現に関わっている可能性が考えられる。本年度はこの宿主因子を解析するための3つの成果を得た。マメ科のモデル生物Medicago truncatulaに近縁のMedicago llittoralisでCIYVVの感染によりえそ病徴を示す系統と示さない系統が得られた。シロクローバモザイクウイルスをベクター化して、エンドウやMedicago llittoralisで外来遺伝子の発現および宿主遺伝子のウイルス誘導型ジーンサイレンシングが可能であることを確認した。さらにエンドウから抽出したタンパク質の2次元電気泳動によりえそ病徴に関わる可能性のある10個のスポットが得られ、質量分析により遺伝子を同定した。一方、キイロショウジョウバエ培養細胞を用いた解析ではCIYVVのHC-ProおよびタバコのrgsCaMによる外来遺伝子の発現増強はmRNAの蓄積と翻訳の両方を促進しているからであることが分かった。HC-Proに結合するショウジョウバエタンパク質を免疫沈降法により分画して質量分析した。キュウリモザイクウイルス(CMV)のサイレンシングサプレッサーである2bタンパク質(2b)については、一般に大腸菌に毒性を示し、インクルージョンボディを形成するため大量生産することが困難であった。しかし、我々はCMV-HLの2bを使用して大腸菌で発現させることに成功し、2本鎖RNA(dsRNA)とin vitroで結合することを明らかにし、2bのサプレッサー活性のメカニズムがdsRNAとの結合であることを証明した。CMV2bと結合する宿主因子の探索に関しては、酵母two-hybrid法によって2bと結合することが判明しているシロイヌナズナのカタラーゼについて2bのC末端側半分に結合することを明らかにした。また、タバコのプロトプラストを用いてサプレッサー活性をモニターするシステムを構築し、2bとカタラーゼの結合が2bのサプレッサー活性に影響することを明らかにした。
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