| 研究概要 |
生体膜上でドメイン形成や、ラフトなどのリン脂質やリン脂質-蛋白質複合体が細胞機能に直接関与していることが分かってきた。しかしそのような凝集体や複合体がいつどのように形成されるかに関しては明らかにされていない。これら凝集体や複合体の形成をいち早く検出するためには、元となる分子の挙動を細胞内で高感度に検出するシステムの構築が急務である。
そこで本研究では、蛍光相関分光法(FCS)を利用して生体膜結性分子複合体の挙動を生きている細胞の生体膜上で2次元的かつ動的に捉えることを目的とした。そのために全反射光学系を採用し、申請者がこれまで研究を進めてきたFCSの特長を生かしつつ、生体膜を対象としてその技術を2次元に広げた全反射蛍光相関分光装置(Total Internal Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy、TIR-FCS)の研究開発を行った。当初の計画では4つであった検出点を,拡大して7箇所として検出効率を高め,実際にバンドル化した光ファイバーの設置と検出器の設定,装置の構築を行った。まず,溶液中の蛍光色素や,蛍光粒子の検出を行い測定領域のキャリブレーション法の確立を行い,次に膜結合GFP蛋白を細胞内発現させ,多点全反射FCS計測により生体膜上での膜結合性分子の検出が可能であることを証明した。本年度は特に機能的なタンパク質をしてNaポンプタンパク質の拡散速度を測定した。まず,HeLa細胞では、a2-EGFPのみ発現パターンが異なること,またCOS7では4つとも同じような発現パターンに見えることを確認した。次にTIR-FCS測定を行い,a1よりa2の方が膜で遅く動いていることを明らかにした。今後,この結果がどのような生理的な反応と関連するのかを明らかにする予定である。
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