| 研究課題/領域番号 |
18300106
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
饗場 篤 神戸大学, 大学院医学系研究科, 教授 (20271116)
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| 研究分担者 |
原田 武志 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助手 (30362768)
葛西 秀俊 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助手 (40403232)
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| キーワード | cdc42 / Cre / Ella-Cre / Rhoファミリー |
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| 研究概要 |
本研究では、RhoファミリーGTPase Cdc42が制御するアクチン細胞骨格の再構成がシナプス形成・維持、シナプス可塑性、運動学習等でどのような役割を果たしているかをin vivoで検討するため、神経細胞特異的Cdc42ノックアウトマウスの作製を計画し、本年度は以下の実績を得た。
1.cdc42遺伝子座にloxPを導入のためのターゲッティングベクターの作製
cdc42遺伝子を含むマウス129染色体DNAを用い、開始コドンを含むエキソンの両側のイントロンに組換え酵素Creによって認識されるloxP配列を導入、さらに選択マーカー一として用いるネオマイシン耐性遺伝子(両端に組換え酵素FLPによって認識されるFRT配列を導入してある)をイントロンに導入し、ネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素A断片を導入してターゲッティングベクターを作製した。
2.ターゲッティングベクターのES細胞への導入
cdc42-floxターゲッティングベクターをマウス129/ola由来のES細胞にエレクトロポレーション法により導入し、240個のG418耐性コロニーをピックアップした。各クローンを培養、染色体DNAを抽出し、サザンプロット解析により、cdc42-floxアリルを持つ相同組換え体1クローンを得た。
3.キメラマウスの作製
得られた相同組換えES細胞をC57BL/6の胚盤胞期胚にインジェクションし、偽妊娠マウスの子宮に導入、キメラマウスを得た。得られたキメラマウスはC57BL/6の雌マウスおよびC57BL/6にバッククロスしたアクチンーFlpトランスジェニックマウスの雌と交配中である。
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