| 研究概要 |
本研究では、NADH特異的なPCB分解菌Pseudomonas sp. KKS102株由来BphA4を改変してNADPH依存的なビフェニル化合物分解酵素系を構築し、シアノバクテリアなどの光合成細菌に組み込むことによって、貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてビフェニル化合物を分解できる新規光合成細菌株を創出すことを目的としている。
1.昨年度に引き続き、さらに高活性なNADPH依存的BphA4作製のために、BphA4の175位と177位に系統的アミノ酸残基置換を施した変異体の基質特異性と酵素機能の速度論的解析を行い、(1)175位負電荷の除去と177位への正電荷導入がNADPH依存的BphA4作製に有用であること、(2)高NADPH依存性変異体では律速段階がFADの還元過程から、青色セミキノン中間体の酸化過程に移動していること、を明らかにした。また、BphA4と特異的電子受容体(BphA3)との複合体のX線結晶解析を行い、電子伝達に伴う立体構造変化と分子認識機構を明らかにした。これらの知見は、さらに高活性なNADPH依存的BphA4変異体の作製と電子伝達系の再構築に有用であるだけでなく、BphA4が属するONFRファミリー酵素の構造・機能を理解する上で学術的にも意義深い。
2.今年度からNADPH依存的ビフェニル化合物分解酵素系(BphA4,BphA3,BphA1A2)の再構築と、シアノバクテリア(ラン藻)への遺伝子導入を開始した。宿主としてSynechocystis sp. PCC6803株を用いて宿主ゲノムへの相同組換えによる遺伝子導入を行い、カナマイシン耐性遺伝子による形質転換体の選択を開始した。また、抗BphA4および抗BphA3ウサギ抗体を作製し、今後の形質転換体中での遺伝子発現の高感度な免疫化学的検出に十分な特異性と反応性を持つことを確認した。
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