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1.殺虫タンパク質上の受容体結合部位の決定
(1)結合阻害モノクローナル抗体による受容体結合部位の大枠での特定
既に作製済みの殺虫タンパク質の受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体の殺虫タンパク質上の結合部位の決定を試みた。これにより、アミノペプチダーゼN受容体は殺虫タンパク質上のドメイン3上にあることが明らかになった。
2.殺虫タンパク質の活性向上変異体作製のためのノウハウの蓄積
(1)受容体への結合親和性の差に即して変異殺虫タンパク質を選抜するためのファージ選抜系の改良
パニング法とビーズ選抜法を比較検討しビーズ選抜法の方が若干受容体に対して結合親和性を増した山中タンパク質変異体の選抜能力において優れていることが明らかになった。また、選抜系に用いる高純度受容体(カドヘリン様受容体)の調製法を確立した。
(2)結合ドメインに部位集中変異を導入した殺虫タンパク質ライブラリーからの結合性向上変異体のスクリーニング
現時点で一番受容体結合に関与すると考えられる部位である殺虫タンパク質ドメイン2ループ部位の4アミノ酸をあり得る全てのでたらめな配列にした8種類の変異体ファージディスプレイライブラリーを完成した。現在、実際に結合親和性が向上した変異体を獲得するためのスクリーニングを上記のビーズ選抜法で開始したところである。選抜前にはストップコドンがある頻度で入ったライブラリーであったが、選抜後の変異体集合にはストップコドンが入ったものは失われており、選抜効果があることが明らかになった。
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