NO誘導損傷塩基オキザニンの遺伝子内生成とその発ガン誘発の化学的・生化学的証明

2007 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18350083
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 牧野 圭祐 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (50159141)
• 研究分担者: 小瀧 努 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (70170264) ; 金折 賢二 京都工芸繊維大学, 大学院・工芸科学研究科, 准教授 (30273543)
• キーワード: 一酸化窒素 / 損傷塩基 / オキザニン / 発ガン / 修復酵素 / 架橋形成 / DNA認識酵素

研究概要

本研究の課題である「NOによってGuaから生成するオキザニン(Oxa)による発ガン機構」を明らかにするために、以下の研究を行った。
(1)DNA認識酵素類のOxa含有DNAオリゴマーへの反応を解析し、T4DNAリガーゼによる短鎖DNAオリゴマー二重鎖からの長鎖DNAオリゴマー二重鎖調製条件を決定し、T4ポリヌクレオチドキナーゼによる末端のリン酸化、制限酵素によるDNA二重鎖塩基配列変換等の条件設定を行った。また、これらのDNA認識酵素類は、反応中にDNA中のOxaと架橋反応をしないことを明らかにした。
(2)細胞破砕液に対して、これまでにin vitro系で確認した修復酵素(大腸菌グリコシラーゼ)と化学合成したOxa含有DNAオリゴマーの架橋生成物が生成するか否かをゲル電気泳動法および質量分析法で解析したが、架橋反応部位に関する情報獲得にはいたらなかった。
(3)Oxa含有DNAオリゴマー60量体を調製し、修復酵素を架橋させてタンパク質-DNAオリゴマー架橋体を調製し、これを試料として全く未解明のタンパク質と架橋したDNAに対する修復機構の解明を行い、この修復にはヌクレオチド除去修復(NER)と相同組換え(HR)双方が関与することを証明した。
(4)NMR構造解析を行い、以下を明らかにした。Oxaの向かい側にCytがある場合はCytのアミノ基はOxaのOの近くにいるが水素結合はなく、Cytの3位のイミノ基とOxaのアミノ間で水素結合あり、構造的にB型からずれているが、基本骨格のずれは小さい。Cytの代わりにThyを配置した場合はThyのイミノ水素はOxaの向かいにいるが強い水素結合はなく、Oxaのアミノ基はThyの2位のカルボニルOと強い水素結合をしており、B型に近い構造をとる。検討を継続する。
(5)Oxaの細胞内生成の証明に関しては検討中であり、引き続き検討を重ねる。

研究成果

• [雑誌論文] Base sequence-and T_m-dependent DNA oligomer separation by open tubular capillary columns carrying complementary DNA oligomers as probes (2007)
  • 著者名/発表者名: K. C. Devarayapalli, S. P. Pack, N. K. Kamisetty, S. Watanabe, T. Kodaki, and K. Makino
  • 雑誌名: Anal. Bioanal. Chem. 388 ページ: 919-928
  • 査読あり
• [雑誌論文] The positive effect of the decreased NADPH-preferring activity of xylose reductase from Pichia stipitis on the ethanol production using xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae (2007)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe, A. A. Saleh, S. P. Pack, N. Annaluru, T. Kodaki and K. Makino
  • 雑誌名: Biosci. Biotech. Biochem. 71 ページ: 1365-1369
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP^+-dependent xylitoldehydrogenase (2007)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe, A. A. Saleh, S. P. Pack, N.Annaluru, T. Kodaki and K. Makino
  • 雑誌名: J. Biotechn. 130 ページ: 316-319
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein engineering of xylose reductase from Pichia stipitis for improved NADH-specificity and the efficient ethanol production from xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae (2007)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe, A. A. Saleh, S. P. Pack, N. Annaluru, T. Kodaki and K. Makino
  • 雑誌名: Microbiology 153 ページ: 3044-3054
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct immobilization of DNA oligomers onto the amine-functionalized glass surface for DNA microarray fabrication through theactivation-free reaction of oxanine (2007)
  • 著者名/発表者名: S. P. Pack, N. K. Kamisetty, M. Nonogawa, K. C. Devarayapalli, K. Ohtani, K. Yamada, Y. Yoshida, T. Kodaki, and K. Makino
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 35 ページ: e110 (10 pages)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nucleotide excision repair and homologous recombination systems commit differentially to the repair of DNA-protein crosslinks (2007)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe, A. A. Saleh, S. P. Pack, N. Annaluru, T. Kodaki and K. Makino Toshiaki Nakano, Soh Morishita. Atsushi Katafuchi, Mayumi Matsubara, Yusuke Horikawa, Hiroaki Terato, Amir M.H. Salem, Shunsuke Izumi, Seung Pil Pack, Keisuke Makino and Hiroshi Ide
  • 雑誌名: Molecular Cell 28 ページ: 147-158
  • 査読あり
• [雑誌論文] Thermostabilization of Pichia stipitis xylitol dehydrogenase bymutation of structural zinc-binding loop (2007)
  • 著者名/発表者名: N. Annaluru, S. Watanabe, S. P. Pack, A. A. Saleh, T. Kodaki and K. Makino
  • 雑誌名: J. Biotech. 129 ページ: 717-722
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biophysical stability and enzymatic recognition of oxanine in DNA. (2007)
  • 著者名/発表者名: S. P. Pack, A. Doi, M. Nonogawa, N. K. Kamisetty, K. C. Devarayapalli, T. Kodaki, and K. Makino
  • 雑誌名: Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 26 ページ: 1589-1593
  • 査読あり
• [学会発表] 酸塩基触媒アセチルヒスチジンによるオキザニンからキサンチンへの構造変換 (2008)
  • 著者名/発表者名: 土井昭宏、S. P. Pack, 野々川満、小瀧努、牧野圭祐
  • 学会等名: 日本化学会第88春季年会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080326-30
• [学会発表] Development of oligo-DNA coupled micro columns for isolation and detection of DNA oligomers (2008)
  • 著者名/発表者名: N. K. Kamisetty, S. P. Pack,野々川満、K. C Devarayapalli,和田啓男、小瀧努、牧野圭祐
  • 学会等名: 日本化学会第88春季年会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080326-30
• [学会発表] Oxanine-induced DNA-protein crosslink as an useful biomaterial fbr elucidation of biological interaction mechanism (2008)
  • 著者名/発表者名: S.P. Pack, 野々川満、N. K. Kamisetty, 小龍努、牧野圭祐
  • 学会等名: 日本化学会第88春季年会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080326-30
• [学会発表] Development of stable DNA microarray platforms suitable for quantitative analysis (2007)
  • 著者名/発表者名: N. K. Kamisetty, S. P. Pack, M. Nonogawa, K. C. Devarayapalli, Y. Yoshida, K. Yamada, T. Kodaki, and K. Makino
  • 学会等名: 5th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: Tokyo Japan
  • 年月日: 20070920-22
• [学会発表] Repair mechanism of DNA-protein cross link damage in Escherichia coli (2007)
  • 著者名/発表者名: T. Nakano, S. Morishita, H. Terato, S. P. Pack, K. Makino, and H. Ide
  • 学会等名: 5th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: Tokyo Japan
  • 年月日: 20070920-22
• [学会発表] Functional reactivity of oxanine: its biological meanings and biotechnological applications (2007)
  • 著者名/発表者名: S. P. Pack, A. Doi, N. K. Kamisetty, M. Nonogawa, T. Kodaki, and K. Makino
  • 学会等名: 5th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: Tokyo Japan
  • 年月日: 20070920-22
• [学会発表] Comparison of enzymatic recognition of DNA-duplexes containing NO-induced lesions by DNA -relevant enzymes (2007)
  • 著者名/発表者名: A. Doi, S. P. Pack, M. Nonogawa, T. Kodaki and K. Makino
  • 学会等名: 5th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: Tokyo Japan
  • 年月日: 20070920-22
• [図書] 「第一章 総論 DNAチップの現状と将来展望」、新しいDNAチップの科学と応用 (2007)
  • 著者名/発表者名: 牧野圭祐
  • 総ページ数: 14
  • 出版者: 講談社サイエンティフィク