ナイロンオリゴマー分解酵素の立体構造解析と人工アミド合成への応用

2009 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 18360400
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物機能・バイオプロセス
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 根来 誠司 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (90156159)
• 研究分担者: 武尾 正弘 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (40236443) ; 加藤 太一郎 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 助教 (60423901) ; 樋口 芳樹 兵庫県立大学, 大学院・生命理学研究科, 教授 (90183574) ; 柴田 直樹 兵庫県立大学, 大学院・生命理学研究科, 准教授 (30295753) ; 中野 英彦 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (20047608)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2009
• キーワード: ナイロンオリゴマー / X線結晶構造解析 / 酵素進化 / βラクタマーゼ / カルボン酸エステル分解酵素

研究概要

Arthrobacter sp.KI72株が保持するプラスミドpOAD2上には、高機能型ナイロンオリゴマー分解酵素(NylB)、およびNylB類似カルボン酸エステル分解酵素(NylB')がコードされており、非天然物質に対する微生物の適応・進化を分子レベルで解析する上で恰好の系である。本研究ではNylB/NylB'およびその基質複合体の立体構造を解析した。また、立体構造から触媒機能に重要と推定されるアミノ酸残基(Ser112, Lys115, Asp181, Tyr215, Asn266, Tyr370)を選定後、各種の変異酵素を取得した。機能変化との相関から、触媒機能に関わるアミノ酸残基を特定した。さらに、NylB/NylB'は、微水系で効率的にアミド合成反応を触媒するが、合成/分解活性の比が181位、187位のアミノ酸置換で大きく影響する現象を見いだした。変異酵素の立体構造解析から非天然アミドの高効率合成に必要な構造基盤を明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of nylon-6 units in organic solvents containing low concentrations of water. (2010)
  • 著者名/発表者名: Kawashima, Y., Yasuhira, K., Shibata, N., Matsuura, Y., Tanaka, Y., Taniguchi, M., Miyoshi, Y., Takeo, M., Kato, D., Higuchi, Y., Negoro, S.
  • 雑誌名: J. Mol. Cat. B: Enzymatic 64 ページ: 81-88
  • 査読あり
• [雑誌論文] X-ray crystallographic analysis of the 6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase: catalytic mechanism and evolution of an enzyme responsible for nylon-6 byproduct degradation. (2010)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira, K. Shibata, N., Mongami, G., Uedo, Y., Atsumi, Y., Kawashima, Y., Hibino, A, Tanaka, Y., Lee, Y-Ho, Kato, D., Takeo, M., Higuchi, Y., Negoro, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 285 ページ: 1239-1248
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the evolution of nylon-oligomer hydrolase NylB. (2010)
  • 著者名/発表者名: Higuchi, Y., Shibata, N., Kawashima, Y., Ohki, T, Negoro, S.
  • 雑誌名: Viva Origino. (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from a carboxylesterase with a βlactamase fold. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashima Y. Ohki T. Shibata N. Higuchi Y, Takeo M, Kato D, Negoro S.
  • 雑誌名: FEBS J. 276 ページ: 2547-2556
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two alternative modes for optimizing nylon-6 byproduct hydrolytic activity from a carboxylesterase with a β-lactamase fold. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Shibata N, Higuchi Y, Kawashima Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 1662-1673
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nylon-oligomer degrading enzyme/substrate complex. (2007)
  • 著者名/発表者名: Negoro S, Shibata N, Kato D, Takeo M, Higuchi Y
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 370 ページ: 142-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] 6-Amino-hexanoate oligomer hydrolases from the alkalophilic bacteria Agromyces sp. strain KY5R and Kocuria sp. strain KY2. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Tanaka Y, Shibata H, Kato D, Takeo M, Negoro S
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 73 ページ: 7099-7102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic organization of nylon-oligomer-degrading enzymes from an alkalophilic bacterium Agromyces sp. KY5R. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Uedo Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng. 104 ページ: 521-524
• [雑誌論文] Mutational analysis of 6-amino-hexanoate-dimer hydrolase. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Wakitani Y, Takeo M, Yasuhira K, Shibata N, Higuchi Y, Negoro S
  • 雑誌名: FEBS Lett 580 ページ: 5054-5058
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and X-ray diffraction analysis of 6-aminohexanoate-cyclic dimer hydro-lase from Arthrobacter sp. KI72. (2006)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Shibata N, Negoro S, Takeo M, Higuchi Y.
  • 雑誌名: Acta Cryst. F62 ページ: 1209-1211
  • 査読あり
• [備考] ホームページ
  • URL: http://www.eng.u-hyogo.ac.jp/msc/msc3/
• [産業財産権] 遊離カルボン酸・アミンの直接縮合反応を触媒する酵素の設計方法及びナイロンオリゴマーの酵素的製造方法 (2006)
  • 発明者名: 根来誠司、武尾正弘、加藤太一郎、樋口芳樹、柴田直樹
  • 産業財産権番号: 特願2006-239119
  • 出願年月日: 2006-09-04
  • 取得年月日: 2006-09-04