研究課題
基盤研究(B)
ベタレイン色素合成に関わる最も重要な酵素であるDOPA4,5-dioxygenase(DOD)相同遺伝子cDNAをオシロイバナ、アラビドプシス、トレニア、カーネーションからクローニングした。このオシロイバナ由来のcDNAを発現性ベクターに導入し、大腸菌に形質転換し、酵素活性について検討したところ、ベタラミン酸が生成していることが認され、試験管内で酵素活性の測定が可能となった。また、ベタレインは糖によって修飾されており、その配糖化はcyclo-DOPAの段階で生じていることを明らかにした。そこで、配糖化酵素に対するcDNAをオシロイバナ、マツバボタン、センニチコウ等から得た。そのアミノ酸配列を決定して、既報の配糖化酵素のアミノ酸配列と比較したところ、ベタシアニンを合成するナデシコ属以外のナデシコ目のみで1つのクレードを形成し、ベタシアニンを合成しないその他の植物種の配糖化酵素とは異なった進化を遂げてきたことが明らかになった。さらにこれら植物種から様々な配糖化酵素cDNAを得て、そのアミノ酸配列の比較と大腸菌発現系における酵素活性を調べた。その結果、フェニルプロパノイドに対する広い基質特異性を示す配糖化酵素cDNAが得られ、とくにセンニチコウからp-クマル酸、カフェ酸、シナピン酸およびフェルラ酸すべてに糖を付加する酵素に対するcDNAが得られた。そこで、このセンニチコウ由来の配糖化酵素とともに大腸菌で発現させたアラビドプシスのスクロース合成酵素を組み合わせることによって、これらフェニルプロパノイドの配糖化化合物を効率よく、大量に酵素的に合成する系を確立した。合成した配糖化化合物を高速液体クロマトグラフィーで精製し、これを基質とすることによって、アントシアニンへのアシル基転移酵素活性の測定を行なうことが可能となった。
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Plant Biotechnol. 25(印刷中)
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