| 研究概要 |
大腸菌Fプラスミドの複製開始タンパク質RepEには単量体と二量体という二つの分子会合状態があり,その分子会合状態の違いで異なる分子機能を有する.RepE単量体は複製起点に結合する複製開始因子であるが,野生型である二量体はrepE遺伝子のオペレーター領域へと結合し転写抑制因子として働く.本研究では,前年度までに野生型RepE二量体とDNAの複合体状態でのX線結晶構造解析に成功し,明らかになった構造と既知のRepE単量体の結晶構造とを比較することで,Fプラスミド複製開始に必要不可欠なDnaK分子シャペロン群がRepEに構造変化を引き起こす際の作用メカニズムを提案した.本年度は,これらのタンパク質分子間に形成される相互作用の解析を目的として,RepEと分子シャペロンとの複合体試料の調製を試みた.まず,RepEとDnaK分子シャペロン群を共発現する系を用いたところ,RepEとDnaKなどが共精製された.しかし,これらは一時的,部分的な複合体と判断されたため,DnaJあるいはDnaKを個別にRepEと混合させることで,安定な複合体試料を得ることを試みた.RepE二量体に対して最初に相互作用すると考えられるDnaJに関しては,大量発現させた大腸菌由来のDnaJタンパク質を精製し,RepEタンパク質と混合させたが,DnaJ自身の凝集しやすい性質などから結晶化に適した試料調製までには至らなかった.DnaKについては全長の発現系だけでなく,基質結合ドメインおよびATP結合ドメインに分割した発現系を用いて試料調製を現在進めている.また,分子シャペロンが相互作用すると予想されるRepEのドメイン間リンカー領域に関して,立体構造情報を基にデザインした複数の変異体を作製しており,これらの変異体の機能解析も進行中である.
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