研究課題
エクトドメインシェディングとは、細胞膜蛋白質が細胞表面でプロテアーゼによる切断を受け、その細胞外ドメインが培養液中に放出される現象を言う。シェディングは、細胞内のシグナル伝達系とプロテアーゼ群を介した複雑な機構によって調節されており、膜タンパク質の活性制御に非常に重要な意味を持つことが明らかになってきている。申請者は、膜結合型細胞増殖因子HB-EGFの作用機構と生理的役割の解析を進めてきたが、その過程でHB-EGFのエクトドメインシェディングの重要性を認識するに至り、HB-EGFを材料にエクトドメインシェディングに関わる細胞内シグナル分子やプロテアーゼについて解析を進めてきた。本研究の目的は、シェディング機構全容の解明にむけて、シェディングに関る分子群を網羅的に明らかにし、シェディングの調節機構と生物学的意義の解明を行うことである。シェディングに関わる遺伝子群を網羅的に同定するために以下の実験を計画した。1)HB-EGFを発現したヒト細胞にsiRNA発現ライブラリーを組み込まれたレンチウィルスベクターを感染し、siRNA発現細胞を得る。2)この細胞にエクトドメインシェディング誘導薬であるTPAを作用させると、ほとんどの細胞ではシェディングが誘導されるが、シェディングが起こらない細胞群を抗HB-EGF抗体で染色して、これをセルソーターで選別する。3)得られた細胞群の中で発現が低下している遺伝子をDNAアレイの手法で同定することで、エクトドメインシェディングに関わる遺伝子を網羅的に明らかにする。4)シェディングに関わることが示唆された遺伝子について個別に詳しく検証し、シェディング機構にどのように関わっているのか明らかにする。上記の実験計画を遂行するために、まず本年はsiRNAライブラリーが実際に稼働するかどうかを試すパイロット実験を実施した。その結果、ここで使用したsiRNAライブラリーは実際にヒト細胞内で遺伝子発現を抑制すること、DNAアレイを用いて細胞内で発現が抑制されている遺伝子の同定が可能であること、を明らかにした。
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