研究課題
海洋性光合成細菌、Rhodovulum sulfidophilumは、細胞外にDNAやRNAを放出している。本研究は、まずこの菌か生産するRNAの解析を行い、次に菌の遺伝子操作法を開発し、最終的に任意の機能性RNAを簡便に、かつ圧倒的低コストで培養液中に製造する方法を開発しようとするものである。昨年度までに強いプロモーターであるリボソームRNAのプロモーター(rrn)をこの菌から取り出しプラスミドに導入することによって、それまでよりも数十倍量のストレプトアビジンRNAアプタマー(ストレプトアビジンに結合する能力を有する人工RNA)を菌を培養するだけで生産させることに成功していた。しかし、生産されたRNAの配列はRT-PCR法などで確認したものの、実際に結合能をもつことを示す実験データは得られていなかったため、本年度、このRNAを精製し、ゲルシフトアッセイ法により活性を確認した。培養で得られたこのRNAアプタマーをin vitro転写のRNAアプタマーと比較したところ、まったく同様のストレプトアビジンへの結合活性が確認された。このことは、人工的機能性RNAである活性を保持するRNAアプタマーを菌の培養だけでその培地に生産できることを世界で初めて示したもので、当該基盤研究の最も重要な部分を達成したことを示す。現在のところ、1Lの培養液当たり100ngが生産できているところで、まだ、量的な点でさらなる研究が必要であった。本菌の培地にはリボヌクレアーゼがないことを確認していたものの培養中に生産されたRNAアプタマーの減少傾向も見られた。このことは、わずかながらリボヌクレアーゼが存在する可能性を示していた。一方、この時点までに生産されていたRNAの末端は、5'-OH、3'-リン酸の形であった。これは、さらなる分解を受けやすいのではないかと考え、転移RNA(tRNA)型の末端、すなわち5'-リン酸、3'-OHのRNAを生産させた。これにより、7倍生産量が上がるという予備的実験結果を得ており、本基盤研究終了後も新たにさらなる改良を目指す研究を進める予定である。
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