微生物のエンドグリコシダーゼを活用した新奇な生理活性物質の生産とその酵素的解析

2007 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 18380058
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 山本 憲二 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70109049)
• 研究分担者: 芦田 久 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40379087) ; 片山 高嶺 石川県立大学, 生物資源工学研究所, 講師 (70346104)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2007
• キーワード: エンドグリコシダーゼ / 糖転移活性 / 糖鎖工学 / 生理活性物質 / グリコシレーション / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / エンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ / グライコシンターゼ

研究概要

本研究は微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用して、さまざまな生理活性複合糖質の組換え型エンドグリコシダーゼの大腸菌による大量発現:糸状菌Mucor hiemalisのエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-M)の遺伝子を大腸菌に導入し、IPTGによる発現誘導を行うことなく、20℃にて長時間培養することにより本酵素を多量発現させることに成功した。2.部位特異的変異により糖転移活性を向上させた変異酵素の取得:Endo-Mの活性中心付近の構成アミノ酸である217番目のTyr残基をPheに置換した変異酵素Y217Fが高い糖転移活性を有することを見出した。3.Endo-Mのグライコシンターゼ化:Endo-Mの175番目のAsn残基をAlaに置換した変異酵素N175Aを取得し、本変異酵素がN-結合型糖鎖に対する加水分解と糖転移活性を失っていたが、反応中間体であるオキサゾリン構造を有する糖鎖を供与体として糖転移反応を触媒することを見出した。反応生成物は加水分解されずに生成し続け、本変異酵素がグライコシンターゼ様に機能することが示された。N175Aを用いて抗HIV活性を有する糖ペプチドを極めて高い収率で酵素合成した。4.エンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの糖転移活性によるムチン型糖鎖のペプチドへの付加:ビフィズス菌の本酵素の遺伝子を大腸菌に導入して得られた組換え型酵素を用い、ガラクトシルβ1-3N-アセチルガラクトサミンα1-pNPを糖鎖供与体として、糖転移活性を検討した結果、SerやThrのみならず、ムチンの部分ペプチドMUClaにもムチン糖鎖を転移付加することを見出した。この結果は人工ムチン合成の可能性を示唆するものである。

研究成果

• [雑誌論文] Mutants of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase Show Enhanced Transglycosylation and Glycosynthase-like Activities (2008)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Huang, W., Li, B., Fujita, K., Ashida, H., Wang, L. -X. and Yamamoto, K.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 283 ページ: 4469-4479
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutants of Mucor hiemalis Endo- 8 -N-acetylglucosaminidase Show Enhanced Transglycosylation and Glycosynthase-like Activities (2008)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Huang, W., Li, B., Fujita, K., Ashida, H., Wang, L.-X., Yamamoto, K
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 283 ページ: 4469-4479
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A Remodeling System for the Oligosaccharide Chain on the Glycoproteins with Microbial Endo-β-N-acetylglucosaminidases (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujita, K. and Yamamoto, K.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta 1760 ページ: 1631-1635
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Application of Transglycosylation Activity of Microbial Endoglycosidases to Syntheses of Bioactive Compounds (2006)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, K.
  • 雑誌名: Trends in Glycosci. Glycotech. 18・99 ページ: 49-62
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Remodeling System for the Oligosaccharide Chain on the Glycoproteins with Microbial Endo-β-N-acetylglucosaminidases (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujita, K., Yamamoto, K
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta 1760 ページ: 1631-1635
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Application of Transglycosylation Activity of Microbial Endoglycosidases to Syntheses of Bioactive Compounds (2006)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, K
  • 雑誌名: Trends in Glycosci. Glycotech 18 ページ: 49-62
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)のグライコシンターゼ化とその反応の解析 (2008)
  • 著者名/発表者名: 梅川碧里、芦田久、Lai-Xi Wang、山本憲二
  • 学会等名: 日本農芸化学会2008年度大会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2008-03-27
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Alteration of Mucor hiemalis Endo- -N-acetylglucosaminidase (Endo-M) to Glycosynthase by Mutation and Analyses of Its Reaction (2008)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Ashida, H., Wang, L.-X., Yamamoto, K
  • 学会等名: Annual Meeting of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry
  • 発表場所: Nagoya
  • 年月日: 2008-03-27
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mutants of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase Show Enhanced Transglycosylation and Glycosynthase like Activities. (2007)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Ashida, H., Wang, L. -X., Yamamoto, K.
  • 学会等名: The 2nd Kyoto U. -Korea U. Joint Symposium on Microbiology and Biotechnology
  • 発表場所: Seoul Korea
  • 年月日: 2007-10-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Mutants of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaininidase Show Enhanced Transglycosylation and Glycosynthase-like Activities (2007)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Ashida, H., Wang, L.-X., Yamamoto, K
  • 学会等名: The 2nd Kyoto-U.-Korea U. Joint Symposium on Microbiology and Biotechnology
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 2007-10-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mucor hiemalis 由来Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)の糖転移機能の改変とその反応解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 梅川碧里、藤田清貴、Wei Huang、Lai-Xi, Wang、芦田久、山本憲二
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成19年度大会
  • 発表場所: 藤沢
  • 年月日: 2007-08-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Alteration of Transglycosylation Function of Endo-β-N-acetyl-glucosaminidase from Mucor hiemalis (Endo-M) and Analyses of Its Reaction (2007)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Fujita, K., Huang, W., Wang, L-X., Ashida, H., Yamamoto, K
  • 学会等名: Annual Meeting of The Japanese Society of Applied Glycoscience in 2007
  • 発表場所: Fujisawa
  • 年月日: 2007-08-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mucor hiemalis 由来Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)が有する特異な糖転移機能の改変及び解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 梅川碧里、藤田清貴、Wei Huang、加藤紀彦、芦田久、Lai-Xi, Wang、山本憲二
  • 学会等名: 日本農芸化学会関西支部例会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2007-05-26
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Alteration and Analyses of Transglycosylation Activity which is Specific Function of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-M) (2007)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Fujita, IC, Huang, W., Kato, M., Ashida, H., Wang, L-X, Yamamoto, K
  • 学会等名: Meeting of Kansai Branch of Japan Society for Bioscience(Biotechnology and Agrochemistry)
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 2007-05-26
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mucor hiemalis 由来エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-M)の大腸菌における発現 (2006)
  • 著者名/発表者名: 梅川碧里, 藤田清貴, 加藤紀彦, 芦田久, 山本憲二
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成18年度大会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2006-09-27
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Expression of Endo-β-N-acetylglucosaminidase (Endo-M) from Mucor hiemalis in Escherichia colt (2006)
  • 著者名/発表者名: Umekawa, M., Fujita, K., Kato, M., Ashida, H., Yamamoto, K
  • 学会等名: Annual Meeting of The Japanese Society of Applied Glycoscience in 2006
  • 発表場所: Osaka
  • 年月日: 2006-09-27
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Endoglycosidases (2006)
  • 著者名/発表者名: Endo, M., Hase, S., Yamamoto, K. and Takagaki, K.
  • 総ページ数: 255
  • 出版者: Kodansha & Springer
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Endoglycosidases (2006)
  • 著者名/発表者名: Endo, M., Hase, S., Yamamoto, K., Takagaki, K
  • 出版者: Kodansha & Springer
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より