| 研究概要 |
カレアラクトンAによる前駆脂肪細胞分化誘導阻害機構解明を行うにあたり、標的因子探索ツールの調製を再度実施するとともに、昨年度検出したカレアラクトン標的因子検出の再現性について検討を行った。具体的には、標的因子探索ツールの調製に際しては、trifluoromethyldiazirinylbenzoic acidとN-tert-butoxycarbonylethylenedioxy-bis (ethylamine)をdimethylaminopyridine, dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide存在下縮合後、trifluoro acetic acidを用いてbutoxycarbonyl基を除去した。さらにNaHCO_3溶液中succinimidyl基を有するアガロース担体とカップリングすることにより、フォトアフィニティーリンカーを調製した。調製したフォトアフィニティーリンカーにカレアラクトンAを紫外線照射により固定することにより、標的因子探索ツールを調製した。また標的因子の検出に際しては、3T3-L1細胞を100mmシャーレ400枚分の細胞を培養し、標的因子発現フェイズ(分化誘導処理1日後)において回収し、超音波破砕により細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液にフォトアフィニティーリンカー・カレアラクトンA複合体を添加し、標的因子の結合を試みた。回収したフォトアフィニティーリンカー・カレアラクトンAをSDS-sample bufferにて処理することにより、カレアラクトン結合タンパク質を回収し、SDS-PAGEを実施後、銀染色により結合タンパク質の可視化を行った。しかしながら再現性よく、結合タンパク質を検出することができなかった。現在その原因を究明することにより、標的因子解明を試みている。
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