| 研究概要 |
計画に基づいて研究を進めたが,特に,
○DNMT1阻害剤5-aza-2'-deoxycytidine(aza-dC)処理マウスm5S細胞の複製フォークの進行速度をゲノムワイドに解析するとともに,FISH法を用いて高メチル化DNA領域のMaSat,MiSatを可視化し,この領域の複製フォークの進行速度を解析した結果,aza-dC処理により,ゲノムワイド,MaSat,MiSatでいずれも複製フォークの進行速度が減速することを示した。その原因としてMaSat,MiSatでDNAの脱メチル化と,それに伴う転写活性化が起きていることを示し,転写因子が複製フォークの進行を妨げ,この領域の複製フォークの進行速度を減速させた可能性を示した。この他aza-dC処理により,DNA複製依存的にDNA損傷が誘導されること,DNA損傷が高頻度に誘導されるマウスセントロメア周辺領域において複製フォーク進行速度が遅延していることなどを見出した。
○ヒト各種培養細胞に対して,BrdUを用いてDNAを複製標識し,間期核FISHによる解析に加えて,マイクロアレイや定量的リアルタイムPCRを用いて,サブテロメア領域のマクロな領域とミクロなゲノム領域における複製タイミングを解析した結果,サブテロメア領域の複製タイミングは細胞間で異なり,同じ細胞であっても染色体によって複製タイミングは異なっていること,多くのサブテロメア領域はテロメアの複製タイミングと一致し,複製タイミングの早い領域が多いこと,一部のサブテロメア領域についての解析から,マクロには,複製タイミングが早い領域ほど,核内部に配置し,GC含量が高く,サブテロメア領域でも複製タイミング,核内配置,GC含量の関係に相関があること,ミクロには,複製タイミングは遺伝子の転写活性よりもヒストン修飾と強い相関があることなどを明らかにした。すわなち,サブテロメア領域において,ヒストン修飾が複製タイミングの制御機構の上流に位置し,エピジェネティックな要因でクロマチンの構造が決定し,その高次クロマチン構造の変化によって複製タイミングが制御されることを示した。
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