| 研究概要 |
上記研究課題に関して,当初の計画に従って研究を行ったので報告する。
精子ユビキチン-プロテアソームシステムは、マボヤ精子の卵外被通過の際に精子通過口を開けるライシンとして機能する事をすでに報告している。当初、卵黄膜主要成分であるHrVC70をユビキチン化する酵素(E1/E2/E3)をマボヤ精子浸出液から精製することを試みたが、構造解析を行うのに十分な量が得られなかった。そこで、カタユウレイボヤを用いて、精巣で発現しているE2とE3をゲノムデータベースから検索することにした。E3に関しては一昨年度の実績報告で報告している。また、昨年度はE2に焦点を当てて探索を行った結果について報告した。すなわち、遺伝子モデルから精巣で高発現している複数のE2候補分子を見出し、それが実際に精巣で発現しているか否かをRT-PCR法により検討し、ある候補分子が精巣と筋肉で特異的に発現していることを明らかにしてきた。今年度は、この酵素が受精に関与するか否かを調べる目的で、GST融合タンパク質として大腸菌で発現させてマウスに免疫し、抗体を作製した。この抗体を用いて免疫染色を行った。また、細胞膜非透過性のNHSビオチンで精子を標識し検討したところ、この酵素は精子細胞内に存在し、表面には露出していないことが示唆された。
一方、配偶子間相互作用に関わる酵素を探る目的で、精子ラフト画分を調製し、LC-MS/MSによりプロテオーム解析を行った。そして、その画分で検出されるE3をゲノムデータベースから検索し、その遺伝子をGST融合タンパク質として発現させて抗体を作製した。この抗体を用いて局在性解析を行ったが、精子細胞膜表面に露出しているという証拠は得られず、精子形成過程等で機能している可能性が示唆された。
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