| 研究概要 |
デュシャンヌ型筋ジストロフィー(DMD)はヒトX番染色体上に存在するDMD遺伝子の機能欠損により引き起こされる進行性筋萎縮症である。DMD遺伝子は全長2.4Mbにも及ぶことからDMDの完全な遺伝子治療は現時点では不可能であった。これまでに我々は巨大な遺伝子を染色体レベルで搭載可能なヒト人工染色体(HAC)ベクターの開発を行ってきた。本研究においてDMD遺伝子をクローニングしたヒト人工染色体ベクターと自己の幹細胞を用いたex vivo細胞遺伝子治療を目指して以下の研究を行った。
昨年度作製したDMD-HACが機能的に発現するかを確認するためマウスES細胞に導入した。ヒト特異的プローブを用いたFISH法、DMD領域特異的プローブを用いたPCR法によりDMD-HACが導入され、かつ正常マウス核型のマウスES細胞株を選別し、そのES細胞を8細胞期胚にインジェクション後、仮親に移植することでキメラマウスを作製した。昨年度はキメラ率(GFP陽性率)低いESラインしか取れなかったのに対し、今年度は20クローンの中から、上記解析により良いESラインを選別することで高キメラ率(GFP陽性)のマウスを獲ることができた。このマウスを用いて各種組織においてDMD遺伝子の組織特異的スプライシングバリアントがヒトと同様に発現しているかをRT-PCR法を用いて解析したところ、脳特異的アイソフォームは脳特異的アイソフォームは脳特異的に、筋肉特異的なアイソフォームは筋肉特異的に発現が観察された。また、DMD-HACをヒト間葉系幹細胞に染色体導入法により導入し、100PDLまで長期培養後、25,50,75,100PDLにて保持率を検討した結果、DMD-HACは安定に維持されることが確認できた。以上のことから DMD-HACが遺伝子治療に利用できるベクターであることが示唆された。
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