| 研究課題/領域番号 |
18390174
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
渡辺 直樹 札幌医科大学, 医学部, 教授 (10158644)
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| 研究分担者 |
辻 直樹 札幌医科大学, 医学部, 講師 (00347171)
小林 大介 札幌医科大学, 医学部, 助手 (50295359)
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| キーワード | 抗IAP抗体 / 癌診断 / 抗体検出アレイ / Immuno-PCR法 |
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| 研究概要 |
SurvivinおよびLivin遺伝子をクローニングするため、ヒト大腸癌細胞および肺癌細胞株よりtotal RNAを抽出し、cDNAを作製した。次にPCR法で両遺伝子を増幅し、サイクルシークエンス法を用いて塩基配列を調べた。塩基配列に変異や欠失、挿入が無いことを確認後、増幅産物をDirectional TOPOエントリーベクターに導入しクローニングした。さらに、大腸菌発現用のディスティネーションベクターpET104 BioEase-DESTに組み換えた。このベクターを大腸菌に導入し、リコンビナントSurvivinおよびLivin蛋白を発現させた。両蛋白のN末端にはビオチンタグが付いているため、ストレプトアビジン-アガロースで両蛋白を回収した。ビオチンタグをエンテロキナーゼで切断後、EIAプレートに固相化し、抗Survivinおよび抗Livin抗体検出用ELISAを作製した。
肺癌患者血清37例を対象とし、抗Survivin抗体および抗Livin抗体の陽性率を調べたところ、それぞれ58.1%、51.3%であり、両者を組み合わせると、71%まで上昇した。また、リコンビナントSurvivinおよびLivin蛋白をSDS電気泳動し、ELISAで陽性と判定された血清を用いてimmuno-blottingを行ったところ、バンドが検出され、本測定系の特異性を確認できた。現在、同様の方法で、リコンビナントNAIP、XIAP、c-IAP1、c-IAP2およびTsIAP蛋白を精製し、自己抗体検出用ELISAを作製中である。
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