| 研究課題/領域番号 |
18390185
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
大前 和幸 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (60118924)
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| 研究分担者 |
中島 宏 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80217710)
佐野 有理 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20338023)
衛藤 憲人 東海大学, 開発工学部, 講師 (60365228)
吉岡 範幸 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70365229)
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| キーワード | 環境保健 / 複合曝露 |
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| 研究概要 |
実験にはヒト末梢血分離リンパ球を使用し、双方とも酸化ストレスを与えDNAを損傷するクロムとコバルトの組み合わせで以下の実験を行った。
1)Cell viabilityの評価
まず始めに、Cr、Coの各々について複数の濃度で細胞培養液中に添加し、細胞のviabilityについての情報を得た。具体的には、培養細胞を重金属の存在下で一時間培養、曝露終了数時間後のviabilityをCytotoxic Fluoro-test wakoを用いて検討した。2)以降で行う実験では、viabilityの有意に低下しない濃度で行った。
2)comet assay
DNA損傷を高感度に検出できるコメットアッセイ(Single Cell Gel Electrophoresis)を行った。まず、リンパ球を重金属存在下で一定時間培養した後、スライド上でアルカリ処理により加水分解させた。次に電気泳動すると、細胞のDNA損傷により断片化したDNAは核外へ移動し、これをSYBR Greenで蛍光染色、彗星状の"Ccmet Tail"パターンを検出した。この"Comet Tail"の長さや形はDNA損傷の程度と相関関係があるため、高感度冷却CCDカラーカメラで撮影後、画像解析ソフトと組み合わせ、DNA損傷レベノレを定量的に評価した。Cr、Co単独曝露で有意に指標が変化する濃度(最小毒性量:LOAEL)を知った後、Cr、Coの最小毒性量の半分量を組み合わせて複合曝露を行った。
3)活性酸素種の測定
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCF-dAC)を培地に加えて1時間インキュベートした。DCF-dACは細胞内に拡散、dichlorofluorescin (DCF)の水和物となり、その水和DCFが活性酸素(ROS)の働きにより測定可能な蛍光物質DCFとなることから、これを利用してROSを測定した。測定にはマルチラベルカウンターを使用した。重金属の曝露濃度は2)と同様に行った。
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