研究課題
(1)新世界サル(タマリン)の霊長類を用いたsiRNA発現AAV8の有効性・安全性の検討新世界サルであるタマリンに対しハウスキーピング遺伝子であるSOD1遺伝子に対するAAV8shRNA発現ベクターを1xlO^<13>v.g./kg,1x10^<12>v.g./kgのウイルス投与量で経静脈的に全身性に投与し、投与3週間後に解剖を施行した。遺伝子が肝臓に導入されていることを確認するために肝臓から抽出したDNAを使用し導入遺伝子に対するPCRによる半定量を行ったところ、投与量に依存して導入遺伝子の存在が認められ、さらに発現したsiRNAの細胞内でプロセスされたアンチセンス鎖をnorthern blottingで確認できた。一方、血液・組織学的に肝障害を始めとする有意な副作用は認められなかった。しかし、siRNAの発現量はタマリンの1/30のウイルス量を投与したマウスの1/3程度の発現しか得られず、肝臓におけるSOD1の発現抑制効果は今回の実験では認められなかった。(2)肝臓への新たなデリバリー方法としてビタミンEをsiRNAのアンチセンス鎖5'末端に直接結合した新規のベクターを開発した(Toc-siRNA)。Toc-siRNAのマウスへの投与はマウスを1日絶食後に経口投与して、尾静脈からアポBに対するToc-siRNAを静注し、48時間後に肝臓を取り出して、定量RT-PCRによりアポB遺伝子のmRNAの抑制、Northern blotでsiRNAの細胞内プロセス、肝細胞内をsiRNAに標識したCy3の蛍光信号を認めた。また、安全性としてToc-siRNA投与後の血算、生化学に加えて、投与3時間後の血清中IFN-α値をELISAにより、肝臓でのIFN-βの誘導を定量RT-PCRにより検索していずれの副作用も認められなかった。
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