P1.リガンドによるGR機能制御機構の解明 (1)リガンドのGRへの結合特性とリガンド-GR複合体の構造を明らかにするため、化合物を結合したGRのin silico modeling、タンパク分解酵素感受性実験、GR機能実験を整備した。 (2)GR分子内ドメイン間相互作用の解析 (1)野生型ならびに変異導入AF-1、DBD、LBD/AF-2のタグ融合タンパク発現系を用いたpull-down解析系の基盤をつくった。 (2)AF-1、DBD、LBD/AF-2各ドメイン間相互作用を解析するためmammalian two-hybrid assayをセットアップした。 (3)GR応答性遺伝子発現パターンの解析と各リガンド選択的標的遺伝子の同定をめざしてヒト肝癌細胞、血管内皮細胞を用いて各種リガンド処理後RNAを採取し、microarrayを用いて遺伝子発現を解析した。 P2.HEXIM1によるGR機能制御機構とそのグルココルチコイド作用調節における意義の解明 (1)HEXIM1発現制御機構の解明 (1)ヒト各組織由来培養細胞におけるHEXIM1 mRNA、タンパク発現解析システムを構築した(各種抗血清は検定済みである)。 (2)HEXIM1遺伝子のプロモーター解析によって発現を制御するシス配列を同定した。 (2)HEXIM1のGR機能調節機構解明 (1)HEXIM1、GRの各種変異体発現プラスミドを発現させ、共免疫沈降を用いて各々の相互作用領域を決定した。現在、それらの領域をさらに狭めつつある。 (2)HEXIM1各機能ドメインのGR機能に与える影響の解明-HEXIM1のNLS、二量体形成領域、CDK9によるリン酸化部位への変異を導入した発現プラスミドの構築と検定を終了した。
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