| 研究分担者 |
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 客員准教授 (30344451)
緒方 直史 東京大学, 医学部附属病院, 客員教員 (10361495)
原 慶宏 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00422296)
原 由紀則 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (30396741)
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| 研究概要 |
本研究の目的はメカニカルストレスによる関節軟骨変性の分子機構を解明することであるが,前年度,メカニカルストレス過剰負荷による関節軟骨細胞の肥大化とMMP-13の発現誘導はRunx2を介していることが示唆され,さらにSox9の分子シグナルの検討については,Soxtrioに関するDNAマイクロアレイを用いた解析からSoxtrioの肥大化,石灰化抑制の標的分子としてS100A1,Bを同定した(EMBOReports,2007)。今年度はメカニカルストレスが誘導するRunx2の上流シグナル分子に着目し,まず,メカニカルストレス過剰負荷刺激に応答してRunx2発現調節を行う分子の同定をおこなった。既に塩基配列が決定しているRunx2のプロモーター領域について,長さの異なるプロモータ-断片とルシフェラ,ゼ遺伝子を組み合わせてレポーター遺伝子を作成し,これを軟骨細胞株ATDC5細胞へstabletransfectionしてクローンを単離した。この細胞に細胞伸張システム(Flexcel社製)による伸張刺激を加え,メカニカルストレスにより誘導される活性を維持するための最小単位までの絞り込みを行った。更に数塩基ごとに変異を入れた変異体を作成し転写因子が直接結合するシスエレメントを同定した。得られたシスエレメントに対して実際に配列特異的に結合する転写因子が存在することを,インスリン刺激により分化を促したATDC5の核抽出物とのelectrophoreticmobilityshnassay(EMsADを用いて証明した(論文発表予定)。今後はメカニカルストレスが誘導するRunx2の上流シグナル分子の詳細な解析と相互作用を検討していき,Sox9に対しても同様に上流分子の同定を目的にSox9のプロモーター解析を行っていく予定である。
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