| 研究課題/領域番号 |
18390534
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
吉田 広 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 教授 (80014330)
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| 研究分担者 |
石井 哲郎 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 教授 (20111370)
柳川 徹 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 講師 (10312852)
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| キーワード | A170 / Peroxiredoxin I / 酸化ストレスタンパク質 |
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| 研究概要 |
1.A170遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの設計と制作
1)LoxPサイトを挿入したターゲッティングベクターの制作:LoxPサイトを5'UTRとA170遺伝子の第1エクソンの後方に挿入したターゲッティングベクターを設計し、制限酵素による切断と結合で制作した。2)エレクトロポレーショシ法によるES細胞への遺伝子導入:上記で出来たターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法によりC57/BL6由来ES細胞に導入した。3)ES細胞のスクリーニング5',3'プローブを用いて、サザンブロッティングによりES細胞にターゲッティングベクターが遺伝子導入されたかをスクリーニングし、ES細胞への遺伝子導入の確認をサザンブロットで17個のポジティブクローンが確認できた。4)Cre-LoxPのサイトの動作確認:相同組み換えES細胞(Targeted allele)を作製しその後Cre処理によりLoxPの間に入っている遺伝子の発現を消失させたところ、exonを含む全てのDeleted alleleとなり、コンディッショナルノックアウトにならないことが判明した。これを確認のためNeomycin配列が残っている状態のES細胞でのmRNA発現を測定し、相同組み換え側のmRNAが十分量発現していることを確認したが、スクリーニングしたES細胞中には、LoxP配列が残っておらず、ターゲッティングベクターの設計をやり直して、ターゲッティングベクターの制作を開始した。
2.酸化ストレスタンパク質の応答の解析
すでに完成しているnullのPeroxiredoxin I(Prx I)遺伝子ノックアウトマウスにB16細胞を移植し口腔癌の転移に果たす役割のフェノタイプの解析をおこなった。また、酸化ストレスとしてのシスプラチンとノックアウト細胞との関連を調べるためシスプラチンの抵抗性を調べた。
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