| 研究概要 |
生物の以前情報が収められているゲノムDNAは電離放射線や様々な環境ストレスでDNA損傷を受けている。いったんDNA損傷が細胞に発生すると、その損傷は即座に検知されるとともに細胞周期チェックポイント機構で細胞増殖をとめるとともに、損傷に適したDNA修復機構で損傷DNAを修復して、生物はゲノムDNAの安定性を維持している、このような一連のDNA損傷応答機構で近年BRCTドメインというタンパク質部分構造を持つタンパク質群が役割を果たすことが報告されてきたことから、本研究ではBRCTドメインをもつタンパク質について、変異型タンパク質のドミナントネガティブ効果を利用して、DNA損傷応答への影響を明らかにするとともに、大腸菌合成BRCTドメインを用いたPull-down法でBRCTドメインと結合するタンパク質を細胞から分離するとともに、プロテオミクス解析で分離したタンパク質の同定を18年度では試みた.
我々はDNA損傷応答との関係が示唆されるBRCTドメインドメインを含むタンパク質のうち、NBS1,BRCA1,BRCA2,53BP1,MDC1のBRCTドメイン欠損の変異タンパク質の発現ベクターを作製し、哺乳類培養細胞に導入して、ドミナントネガティブ効果によるこれらの内在性遺伝子の不活性化によるDNA損傷応答への影響を検討した.BRCTドメインに変異のあるNBS1を導入すると、正常細胞ではDNA二重鎖切断(DSBs)部位で見られる損傷応答タンパク質のフォーカス形成が抑制されるとともに、DSBs修復の主要機構の一つ、相同組み換え(HR)修復も抑制されていた。また、BRCTドメイン変異型BRCA1の導入でもフォーカス形成の抑制効果とともにHR修復への影響も見られた.以上の結果から、これらの因子はDSB損傷応答に機能することが示唆された。
また、これらの因子の機能の分子機構を明らかにする為にBRCTドメインのみの合成タンパク質を用いて、すごさ用タンパク質を分離すると、BRCTドメインと結合する可能性がある候補タンパク質を複数同定することができた.今後、これらの同定タンパク質の機能を解明することにより、BRCTドメインタンパク質のDNA損傷応答への役割の詳細を明らかにする予定である.
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