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最近我々はシトシンバルジに特異的に結合し、特徴的な蛍光を発する低分子リガンド(DANP)を発見した。本研究では、我々が開発したDANPを用いることによりこれら蛍光法の欠点を克服した画期的なSNP(Single Nucleotide Polymorphisms)タイピング法の開発を行うことを目的とした。本年度はSNPタイプ別蛍光パターン作成と、蛍光プレートリーダーでの検出法確立を重点に研究を行った。
SNPタイプ別蛍光パターン作成
(1)作成条件の確立
我々は既に行っていたシトシンバルジ構造にDANPが結合した際の電子スペクトルの特徴についての予備実験をもとに、電子スペクトル、特に蛍光スペクトルをSNPタイプ別蛍光パターン化した。このパターン作成の際のプローブの長さ、緩衝溶液の塩濃度、pH、DANP濃度などの条件について調べ、バックグランド蛍光と有効シグナルのS/N比が最大になるような条件を検討した結果、プローブとして16塩基対以上のDNAを使うことで、再現性よくSFPタイプ別蛍光パターンを検出できた。
(2)プローブの設計
本研究の特徴の一つはプローブ設計の柔軟性にあり、プローブの配列によりシトシンバルジをSNPサイトの5'側、もしくは3'に任意に選ぶことができる。また、SNPサイトの3'側、5'側のがともにグアニン-シトシン塩基対である場合には、これを回避するために、プローブ側のグアニンをイノシンに置き換えたイノシンプローブを使用し、タイピングを検討することができる。これらの方法で確立した条件を使ってプローブを設計し、シトシンバルジとDANP複合体からの蛍光を蛍光プレートリーダーを使って観測し、SNPタイプ別蛍光パターンを作成できた。
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