| 研究概要 |
細胞の配向と細胞密度上昇に伴う接触状態の違いが凍結解凍過程において細胞に与える影響を明確にすることを目的とし,本年度は,第1に配向制御された単層培養細胞を各方向から凍結させ解凍後の蛍光画像解析により生存率を求め,第2に懸濁細胞の凍結時の密集に伴う接触が解凍後の生存率に与える影響を調べた.ヒト皮膚繊維芽細胞(Cell Systems Fb Cells)を継代培養したものを実験に用いた.カバースリップ(松浪24x24×0.7mm)に磨紙(#1000)で一方向に溝加工し滅菌後,細胞を播種し2日間その上で単層培養(細胞密度:5×105cells/cm2)したものを配向制御試料とした.試料に傾斜をつけることで凍結方向を可変出来る実験系を実現した.凍結保護物質として10%ジメチルスルポキシドを用い,4〜-80℃の範囲で0.1〜10℃/minの冷却速度で凍結させ-185℃以下で保持した直後に解凍した.その後試料を蛍光染色[同仁化学Calce量n AM(生細胞),DAPI(死細胞)]し,蛍光倒立顕微鏡(ニコンTE300DEF-S),デジタルCCDカメラ(浜松ホトニクスORCAER),画像処理・解析システム(前年度購入)を介しパーソナルコンピュータに蛍光と位相差画像を取り込み,細胞の2次元的生存分布状態と生存率を求めた.更に,上と同冷却条件において懸濁細胞(初期細胞密度:106cens/cm3)を高分子ピアルロン酸の粘性で制動隔離し凍結し,解凍後にトリパンブルー染色法により生存率を求めた.結果として,配向制御試料の凍結実験より,細胞の配向よりも凍結方向や基質の違いによる細胞周りの氷晶形成状態の相違の方が生存率に影響を与えることが示唆された.そして,懸濁細胞の凍結実験より,緩速冷却条件で凍結中の細胞の密集に伴う接触により生存率が低下することが明らかとなった.
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