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1.p-SINE1 siRNA生成に関与するイネDCL (Dicer-like)遺伝子の同定
イネの5つのDCL遺伝子(DCL1〜DCL5)のそれぞれの発現を抑えたイネ培養細胞系統から低分子量RNAを精製して、p-SINE1 siRNAをノーザン解析で検出した。その結果、すべての系統でsiRNA量が野生型より減少していたが、特にシロイヌナズナDCL3の2つのオルソログであるDCL3とDCL5のそれぞれの発現抑制系統においてsiRNA量が大きく減少することが確認された。この結果はp-SINE1 siRNAの生成に複数のDCLタンパク質、特にDCL3とDCL5、が関与していることを強く示唆する。
2.p-SINE1の発現抑制へのsiRNA関与の解明
前項と同じ培養細胞系統から全RNAを抽出し、p-SINE1転写産物をノーザン解析で検出した。その結果、前項の解析で特にp-SINE1 siRNA量が減少したDCL3とDCL5の発現抑制系統において顕著にp-SINE1転写産物量が増加することが確認された。この結果はp-SINE1の発現抑制にsiRNAが関与していることを強く示唆する。また、これらのDCL発現抑制系統におけるp-SINE1配列のメチル化を調べた。その結果、DCL3とDCL5の発現抑制系統におけるメチル化程度に野生型との大きな違いはなく、p-SINE1転写産物量の増加とp-SINE1配列のメチル化の減少との間には相関が認められないことがわかった。この結果は、p-SINE1の発現抑制にDNAメチル化による転写抑制以外の機構が関与していることを示唆する。
3.p-SINE1 siRNAが由来するp-SINE1配列内の領域の特定
p-SINE1配列(122bp)を複数の領域に分け、領域ごとのsiRNAの量をノーザン解析により比較したが、領域による大きな違いは認められなかった。この結果はp-SINE1 siRNAがp-SINE1配列全体から生じていることを示唆する。
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