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これまでの研究により、申請者はイネのSAPKが高浸透圧ストレスに応答して速やか(1分以内)に活性化されること、この活性化は未同定の上流キナーゼによるリン酸化によるものであることを明らかにしてきた。本研究ではSAPKの標的因子の同定及びSAPKをリン酸化し、活性化する上流キナーゼを明らかにする目的で研究を進めた。
(1)SAPK2のin vivoにおける標的基質の同定
高塩処理と無処理の培養細胞から抽出したタンパク質を、それぞれを二次元電気泳動によって展開し、リン酸化タンパク質を特異的に染色することができるPro Q Diamondによって染色後両区を比較することによって高塩処理によってリン酸化されるタンパク質を選抜した。選抜したスポットについて、TOF-MASSによりタンパク質を同定した結果、α-チューブリン、SEC14ホモローグ、HSP70であった。これらのタンパク質を大腸菌で発現させ、SAPK2の基質となるか否かを検討した結果、α-チューブリンとHSP70はSAPK2によってリン酸化されることからとSAPK2の基質である可能性が示唆された。
(2)SAPK活性化に関わるプロテインキナーゼの同定の試み(18年度計画の継続)
SAPK2のATA結合部位のリジンをアラニンに置換した不活性型SAPK2(SAPK2K/A)を基質してSAPKキナーゼの特徴調べた結果、SAPKキナーゼはカルシウム依存的にSAPKをリン酸化ことが明らかとなったが、その候補の同定にはいたらなかった。
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