| 研究概要 |
前年度の研究を発展させるために,コフィリンをリン酸化し不活性化するLIM-kinase(LIMK)と,リン酸化コフィリンを脱リン酸化して活性化するフォスファターゼであるSlingshot(SSH)の初期胚での発現を抑制することを試みた。しかし,アンチセンスモルフォリノオリゴの注入では,タンパク質の発現を効果的に抑制することはできなかった。そこで,コフィリンのリン酸化の意義を解析するため,恒常活性化型のLIMK変異体のmRNAを注入して,内在のコフィリンのリン酸化レベルを人為的に上昇させることを試みた。その結果,内胚葉の嚢胚形成運動に著しい異常が出現したが,外胚葉や中胚葉の運動はあまり撹乱されなかった。その一方,SSHのドミナントネガティブ変異体の注入では,外胚葉のepibolyや中胚葉の収束的伸長に阻害が観察されることから,これら外・中胚葉の運動にはコフィリンの脱リン酸化による調節機構が,内胚葉の運動にはコフィリンのリン酸化あるいはリン酸化と脱リン酸化の両者の調節機構が深く関与することが推測された。
さらに,SSHのリン酸化調節機構の意義を明らかにするため,SSHのリン酸化のアッセイ系を確立し,SSHのTai1ドメインのN端側に1カ所,中央領域に2カ所,そしてC端側に1カ所,合計4カ所のリン酸化部位が存在することを突き止めた。そして,このTailドメインにはSSHのアクチン結合部位もフォスファターゼ活性部位も存在しないこと,さらにリン酸化されてもSSHのフォスファターゼ活性は変化しないにも関わらず,このドメインを胚内で発現させると著しい嚢胚形成運動の阻害を引き起こすことが見出された。したがって,SSHのリン酸化は,正常な嚢胚形成運動に極めて重要であることが強く示唆された。
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