| 研究概要 |
筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseはリン酸化中間体(EP)の形成、異性化、および加水分解を経てCa^<2+>を輸送する。小胞体lumenへのCa^<2+>放出は、膜ドメインの輸送部位にCa^<2+>を閉塞したCa_2E1P(ADP感受性EP)からCa^<2+>非結合型のE2P(ADP非感受性EP)への異性化過程でおこる。この過程で本酵素の細胞質ドメイン(A,P,N)のAドメインが大きく回転してPドメインと結合し、この変化が膜ドメインに伝わってCa^<2+>の親和性低下と脱閉塞がおこる。Aドメインは3本のloopで膜ドメインのhelices(M1,M2,M3)に繋がっている。筆者は、これらのうちAドメイン/M1-linker(Glu^<40>-Ser^<48>)の長さが適切であることがEPの転換から分解までの各過程に重要であることを示した。すなわち、このA/M1-linkerを1残基分短くするとEPのADP感受性の消失、およびE2Pの加水分解が阻害された。一方、このlinkerに2個以上のGlyを挿入して伸長すると、lumenへのCa^<2+>の脱閉塞が選択的にblockされ、ADP非感受性のCa_2E2Pが蓄積した。以上より、1段階で記述されていたCa_2E1P→E2Pが、ADP感受性の消失とそれにつづくCa^<2+>脱閉塞の2段階で起こる(Ca_2E1P→Ca_2E2P→E2P)ことが明らかとなった。このlinkerにstrainが発生することがCa_2E2P→E2PでのCa^<2+>脱閉塞に重要であると考えられる。さらに、この過程についてタンパク質立体構造の観点から解析する(結晶化)ことを最終目的として、A/M1-linkerのGly^<46>/Lys^<47>に4Glyを挿入した変異体(4Gi-46/47)にリン酸アナログとしてBe/フッ素を結合させた安定なCa_2E2Pアナログを開発した。
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