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T細胞活性化を始めとしたシグナル伝達における脂質ラフトの役割を理解するためには、ラフトの物性を規定する構成脂質の組成や局在様式を明らかにすることが必要である。特に、細胞膜ラフトの脂質二重膜外葉・内葉における脂質の分布状態は外葉・内葉各々に局在するシグナル伝達分子の挙動を規定する因子として重要と考えられるが、解析手段が限られているために不明な点が多い。そこで、ラフトの主要構成成分であり、シグナル伝達のためのプラットフォーム形成に必須の分子と考えられているコレステロールについて、その細胞膜外葉・内葉における局在様式を解析する方法の開発を行った。脂質ラフトの細胞膜内葉側に局在するコレステロールの検出のため、コレステロールに富む膜領域に選択的に結合する性質を持つタンパク質毒素(θ毒素)の断片(D4)をGFPとの融合分子(GFP-D4)として細胞内で発現させた。細胞膜外葉側のコレステロールはθ毒素の無毒化誘導体(BCθ)を細胞に結合させることによって解析した。生化学的な解析から、ラフトに局在するGFP-D4の大部分が細胞膜に内葉側から結合していることが示され、この細胞内発現系が細胞膜ラフトの内葉に局在するコレステロールの解析に利用できることがわかった。細胞膜外葉側に結合させたBCθと細胞膜内葉側に結合させたGFP-D4がいずれもラフト膜画分の中のコレステロールに富む膜亜集団に回収されることから、細胞膜には、脂質二重膜の外葉・内葉いずれもがコレステロールに富む構造をしたラフト膜亜集団が存在していることが示唆された。
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