バキュロウイルスディスプレイ法を用いた免疫担当細胞膜蛋白質間相互作用の解析

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18570120
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 先浜 俊子 東京大学, 先端科学技術研究センター, 産学官連携研究員(特任助教授) (70187061)
• 研究分担者: 浜窪 隆雄 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90198797)
• キーワード: 蛋白質相互作用 / 膜蛋白質 / 免疫学 / バイオテクノロジー

研究概要

1.GITRL及びGITR発現組み換えバキュロウイルスの作成と遺伝子発現の確認
すでに単離されているマウスGITRL cDNAにエピトープタグを付加し、バキュロウイルス用トランスファーベクターに組み入れたコンストラクトを作成した。このプラスミドを用いてGITRLを発現する組み換えウイルスを作成した。
マウスGITR cDNAをPCR法でcDNAライブラリーよりクローニングし、GITRLと同様の方法でGITR発現組み換えバキュロウイルスを作成した。
GITRL及びGITRの発芽型バキュロウイルス(BV)画分での発現を、抗タグ特異抗体を用いたWestern Blotで確認した。
2.cDNA発現ライブラリースクリーニングシステムの開発
抗原提示細胞の膜蛋白質を発現するBVと抗ウイルスエンベロープ蛋白質gp64抗体、及び抗マウスIgG結合磁気ビーズを用いて、cDNA発現ライブラリーのスクリーニングを行い、BV上に発現させた膜蛋白質の生理的リガンドを発現する細胞の濃縮に成功した。
3.クラスII MHC cDNA保有組み換えバキュロウイルスの作製とclass II MHCヘテロダイマーのBV上での再構成
マウスclass II MHC I-A^dα鎖、β鎖cDNAをcDNAライブラリーより単離し、これらを各々、バキュロウイルス用トランスファーベクターに組み入れたコンストラクトを作成した。1と同様にして、α鎖、β鎖のcDNAを各々保有する組み換えバキュロウイルスを作成した。α鎖組み換えウイルスとβ鎖組み換えウイルスをSf9細胞に共感染させ、培養上清よりBVを回収して、BV画分でのclass II MHC蛋白質の発現を、抗エピトープタグ抗体を用いたWestern Blot及び抗class II MHC抗体を用いたELISAにより確認した。