研究概要 |
1.GalNAc4S-6ST遺伝子ノックアウトマウスの作製と,GalNAc4S-6STの機能解析。 GalNAc4S-6ST遺伝子をホモで欠損するマウスを作製した。ホモの個体は各組織におけるコンドロイチン硫酸Eの合成が消失していた。骨髄細胞由来の肥満細胞ではCS-E合成の消失,Tryptase活性の減少が観察された。 2.細胞レベルでのCS-Eの合成機構と機能解析。 C4ST-1を発現しているラットコンドロザルコーマ細胞にGalNAc4S-6ST遺伝子を導入し,CS-Eを含むプロテオグリカンを合成,分泌する細胞を作製し,この細胞がコンドロイチン硫酸Eを合成することを示した。この細胞の合成するコンドロイチン硫酸は親細胞の合成するコンドロイチン硫酸に比べて糖鎖長が約半分になっており,GalNAc4S-6STによる硫酸基の導入が糖鎖長決定に影響していることが示唆された。 3.硫酸転移酵素の細胞内局在,酵素活性の発現,基質特異性に及ぼすN-結合糖鎖の機能。 C6ST-1に付加するN-結合糖鎖を部位特異的変異導入により除いた種々の変異C6ST-1を作製し,これらの変異タンパク質の酵素活性,細胞内局在,特異性を調べ、C6ST-1のN-グリカンが酵素活性,酵素の細胞内局在,酵素の特異性に機能していることを明らかにした。 4.イカ軟骨に含まれるGalNAc4S-6STのクローニングとリコンビナント酵素の調製,その応用 リコンビナントイカのGalNAc4S-6STをCOS-7細胞で発現し,in vitroでのCS-E合成に利用した。in vitroで合成されたCS-EはThrombin活性をAntithrombin III非依存的に阻害し,Heparinとは異なる機構でThrombinを阻害することが明らかになった。
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