| 研究課題/領域番号 |
18570171
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
石田 典子 東北大学, 大学院医学系研究科, 助手 (10361073)
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| 研究分担者 |
中山 啓子 東北大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60294972)
中谷 雅明 東北大学, 大学院医学系研究科, 助手 (70422095)
原 賢太郎 東北大学, 大学院医学系研究科, COEフェロー (60400248)
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| キーワード | 蛋白質 / 細胞周期 / GO期 / CDKインヒビター |
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| 研究概要 |
GO期特異的に形成されるp27巨大複合体構成因子の同定・機能解析を目標として本研究を行った。p27は細胞増殖の抑制を引き起こす負の調節因子であり、GO期から細胞周期に再進入する際にタンパク質分解により発現量が急速に減少する、重要な鍵分子である。このp27のSer10部位をAlaに置換した非リン酸化型ノックインマウスを作製・解析したところ、本来非常に安定であるGO期にp27タンパク質が不安定化し、p27発現量が低下することが明らかとなった。予備実験の結果、GO期にp27は巨大な複合体を形成すること、その巨大複合体の形成は増殖シグナルであるPI3キナーゼ活性によって阻害されることが明らかとなり、その結果p27が不安定化することが示唆された。本研究ではこのGO期特異的なp27の巨大複合体プロテオミクスを行い、その構成因子を明らかにすることを試みた。
まず293T細胞にFLAGタグを付加したp27を発現させ、PI3Kインヒビター処理により細胞周期を停止させた細胞に特異的に結合する分子群を、抗FLAG抗体カラムを用いて濃縮し、p27複合体プロテオミクスを行った。その結果、30種類弱のタンパク質をPI3Kインヒビター存在下のp27結合分子として同定することに成功した。残念ながらこれらp27結合分子の多くは既知であり、残りの結合因子について解析した結果、これらの中にもGO期においてp27と複合体を形成する分子群を見出すことは出来なかった。そこで癌細胞株の使用を止め、GO期に停止させた正常細胞株を用いてその細胞抽出液をサイズ分画後、高分子分画に存在する内在性p27の複合体解析を試みた。この高分子分画に含まれるp27結合分子をSDS-PAGE後に銀染色したところ、特異的な5本のバンドが存在することが明らかとなり、これら5つの構成因子を同定中である。当初の目的は達成されていないが、方法に関しては確立しており、複合体の構成因子も可視化出来ているため、まもなく同定出来ると考えている。その後は機能解析まで進める予定である。
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