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1)ボツリヌスHAの精製
本年度は、HAの作用機序解明のため計画に従いまずB型のnative HAおよびNAP-16(HA+NTNH)を調製した。ボツリヌスB型lamanna株の大量培養を行い、高純度のボツリヌスHA(少量)およびNAP-16(HA+NTNH)(多量)の精製に成功した。
2)ボツリヌスHAの細胞局在の観察
多量に調製することに成功した上記のNAP-16を蛍光ラベルし、TJ機能低下が保持されていることを確認した。このNAP-16がTJ機能低下を引き起こす過程での細胞内動態をconfocal顕微鏡により観察することに成功した。
3)ボツリヌスHA中の機能ドメインの同定
HAはHA1、2、3a、3bの4つの異なるサブユニットから構成されている。それらのどの部分が本活性に必要であるのかが明らかになればHAの作用機序解明に重要な知見を与える。HAの各サブユニットは強固な非共有結合で結合しており、変成されずにそれぞれを単離することは不可能であるので、recombinantタンパク質として各サブコンポーネントを大腸菌に発現させて調製した。recombinant HAサブコンポーネントを混合してHA分子を再構成させた場合、活性を発現させることに成功した。再構成の効率を高めるために、それぞれのサブユニットの混合比、温度、時間などの条件を検討し、最適な混合条件を決定した。その結果、native HAとほぼ同等の比活性を持つrecombinant HAを作製することに成功した。
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