| 研究概要 |
Hyperplastic discs(hyd)は、アミノ酸配列の相同性からHECTドメインを持つ単量体ユビキチンリガーゼとして機能する事が推定されている.我々はショウジョウバエ変異体の解析から、hydがヒト疾患に重要な関わりを持つhedgehog(hh)およびdecapentaplegic(dpp)のシグナル伝達制御に重要な働きをしている事を既に報告した(2002,Lee, et. al.).また、hydはhhのみならずwingless(wg)シグナル伝達制御にも重要な機能を持つ事を明らかとしている(未発表).本研究計画の最も重要な目標は、hydがHECT型ユビキチンリガーゼとしての活性を持つことを確認するとともに、その活性に依存してユビキチン化される標的タンパク質を同定し、それによってhydがhhあるいはwgによるシグナル伝運を制御する分子機構を解明する事である.標的タンパク質を単離・同定するための実験手法はyeast-two hybridスクリーニングおよびGST融合タンパク質を用いたin vitro結合実験である.今回、ホモロジー検索により推定されたhydタンパク質機能ドメインのうちUBAドメインおよびPABPドメインのスクリーニングを終了し、いくつかの結合タンパク質を同定した.また培養細胞抽出液およびGST-hyd融合タンパク質を用いたin vitro結合実験によりショウジョウバエのユビキチン結合酵素bendlessとhydが特異的に結合することを確認し、その結合部位を同定した.よって単離・同定されたユビキチン化標的タンパク質のhydユビキチンリガーゼ活性依存的なユビキチン化はbendlessタンパク質との組み合わせによりin vitroで確認する事が可能である.ユビキチン化標的タンパク質の結合部位としては、他にもhydタンパク質のほぼ中央部に位置するリングフィンガー型zinc finger領域が良い候補として考えられ、現在、さらにこの領域のスクリーニングを継続中である.
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