| 研究概要 |
我々の研究室で開発したゴルジ体のearly, lateのサブコンパートメントを免疫学的に分離して精製する方法が,ペリフェラル膜蛋白質の局在,機能解析に用いることができるか評価するための実験をまず行った.ゴルジ体の各サブコンパートメントで機能するペリフェラル膜蛋白質を検出するためにHAタグとの融合蛋白質として染色体から発現する株を作製した.また抗体が取得できたものに関しては抗体を用いて局在を検出した.ARFのGDP/GTP Exchange Factor (GEF)として機能するGea1,Gea2に関してゴルジ体のサブコンパートメント精製法によりその局在を決定したところ,early Golgiに多く存在することが明らかとなり,過去の報告から機能すると推定されていた場所と一致することがわかり,サブコンパートメント精製法がペリフェラル膜蛋白質の局在決定に有効であることが明らかとなった.またRabファミリー蛋白質であるYpt1,Ypt31のGEFで複数のサブユニットからなるTRAPPに関して同じ実験を行ったところ,late Golgiに多く存在するという新規の知見を得た.本研究の2年目の計画でその機構,意義について解析する.一方でARFやそのGTPase Activating Protein (GAP)であるGlo3,Gcs1について同じ方法によりその局在を調べたが,免疫沈降に用いたビーズへの非特異な吸着が起きてしまい,局在を正確に決定をすることができなかった.本研究の2年目の計画により他の材質からなるビーズを用いて系の改良を試みる予定である.以上本研究計画1年目では既知のペリフェラル蛋白質を用いた検出系により,この系の有効な点,改良すべき点が明らかとなり,2年目に行う計画であるゴルジ体で機能するペリフェラル膜蛋白質の網羅的な同定のため重要な基礎的知見を得ることができた.
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