| 研究概要 |
大腸菌を用いて実験を行い、菌体外のグルタチオンを分解するGGTおよび取り込むYliABCDトランスポーター破壊株に、グルタチオン生合成系の2つの酵素遺伝子(GshAについてはイニシエーションコドンTTGをATGに換えたもの)を多コピープラスミドにのせたものと、別の多コピープラスミドにCysE(セリンアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子(システインに対する脱感作変異を導入したもの)を導入し、大腸菌の菌体外にグルタチオンを発酵生産することを検討したところ、野生型の大腸菌では数μMの蓄積しか見られなかったものが、500μM蓄積するようになった。GshAについてはW100L変異の導入により脱感作すると予想されたが、実際には脱感作せず、A494G, A495F変異を検討することにし、変異導入を行った。GGTのX線結晶構造解析が完成し、GGTの立体構造を初めて。また、グルタチオンを結晶にソーキングしたところγ-グルタミル結合が切れ、γ-グルタミル酵素中間体構造を解くことができ、グルタミン酸と酵素がインタラクションしている残基を特定することができた。しかし、Cys-Glyが結合する残基の同定はできなかったので、新規に開発したγ-グルタミル結合が切断されることのないグルタチオンアナログを野生型酵素にソーキングして、X線結晶構造解析を行っているところである。一方、自己触媒的プロセシングが欠損となったT391A変異型酵素を用いたX線結晶構造解析により、前駆体の構造が明らかとなった。その結果、生化学的実験からすでに明らかにしていた通り、自己触媒的プロセシング反応においても、酵素反応と同じくT391の側鎖の酸素原子が求核原子として働いていることが明らかとなった。また、プロセシングの際に、全体的な構造の変化はないものの活性中心付近の構造が変化し、活性中心が形作られることが明らかとなった。
|
