| 研究課題/領域番号 |
18580080
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
廣瀬 遵 宮崎大学, 工学部, 助教授 (60264363)
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| 研究分担者 |
古川 謙介 九州大学, 農学研究科, 教授 (90221556)
湯井 敏文 宮崎大学, 工学部, 助教授 (50230610)
菅本 和寛 宮崎大学, 工学部, 助手 (10274771)
横井 春比古 宮崎大学, 工学部, 教授 (00253815)
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| キーワード | オキシゲナーゼ / コンビナトリアルケミストリー / DNAシャフリング / キメラ酵素 / 分子動力学的計算 |
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| 研究概要 |
芳香族炭化水素の初期酸化に関与する芳香環酸素添加酵素(オキシゲナーゼ)は、基質特異性が広く、多くの化合物を酸化する。ビフェニルジオキシゲナーゼ(BDO)が触媒する反応を利用してコンビナトリアルな合成の組み合わせ素材となるようなモノ及びジヒドロキシ化合物を取得することを最終目的として、DNAシャフリングによって既に構築されている20種類のキメラBDOを使用した以下の研究を行った。
1.医薬中間体として市販されている6種類の芳香族化合物に対するキメラBDOの変換能を網羅的に調査した。調べた化合物のうち、1-phenylpyrazole並びindanに対する変換能を示すBDO変異体を選抜した。さらに、キメラBDOを発現している組換え大腸菌を培養するための培養条件を再検討し、従来よりも4倍の高効率で芳香族化合物を変換できる菌体を得ることができた。
2.BDOのヒドロキシル基導入の位置選択性及びエナンチオ選択性の改変を目的としてBDOへの部位特異的変異導入を試行した。indanに対する高い活性示すキメラBDOをコードすbphA1(1039)を鋳型として、Phe377をAlaまたはGlyに置換した変異体を取得した。
3.部位特異的変異導入によるBDOの機能改変を行う場合に、立体構造に関する情報は有用である。7種類のキメラBDOの立体構造をナフタレンジオキシゲナーゼ及びRhodococcus由来のBDOの結晶構造データーを基にして、ホモロジーモデリングによって構築した。これに基質ビフェニルを導入したBDO-基質複合体について分子動力学的計算に基づく分子シミュレーションを実施し、活性ポケットの基質近傍に存在すると推定されるアミノ酸残基の動的挙動を観察した。
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