| 研究概要 |
多細胞体形成における糖鎖の役割は受精、発生、分化過程の中で指摘されてきた。しかし、糖鎖と標的分子との結合活性の低さゆえに、糖鎖分子そのものを用いての機能解析には困難さが伴う。これまでに粘菌細胞において報告のあった糖タンパク質の接着分子、内在性レクチン、細胞外マトリックス等を介しての多細胞体形成に焦点をあてる。多細胞体形成における糖鎖の機能を糖鎖欠損変異株、糖鎖遺伝子を通してより明確化し、網羅的に捉えようとするのが本研究の目的である。粘菌細胞は一倍体であり、種々の糖鎖欠損突然変異株の単離が容易である。この特性を生かし、可能な限りの糖鎖欠損変異株を単離する。粘菌細胞野生株を変異原処理し、4〜5日間培養後、FITC標識レクチン(ConA、WGA、PNA、MAL、UEAI等)とフローサイトメーター(EACS Vantage SE)により,各種レクチン蛍光ネガティブの細胞群を一次スクリーニングとしてプールし、次に一旦プールした細胞群を二次スクリーニングにより単一細胞としてソーティングする。各種レクチンに対する反応ネガティブのクローンを単離する。粘菌細胞突然変異株を作出するためのニトロソグアニジン処理条件をまず決定した。これまでの1.6mg/mlニトロソグアニジン濃度、20分間処理では粘菌細胞の突然変異株は作出できず、より低濃度1.2mg/ml〜0.4mg/ml、20分間処理での最適条件を検討した。また、フローサイトメーターを用いての選別条件を決定した。FITC標識プローブとして用いるレクチン濃度、単一細胞を96穴プレートに選別するための条件を求めた。
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