| 研究課題/領域番号 |
18590053
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
川嵜 伸子 立命館大学, 総合理工学研究機構, 教授 (70077676)
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| 研究分担者 |
川嵜 敏祐 立命館大学, COE推進機構, 教授 (50025706)
マー ブルース ヨン 立命館大学, COE推進機構, 助教授 (00378788)
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| キーワード | マンナン結合タンパク質 / 血清レクチン / ヒト結腸癌細胞 / 糖鎖リガンド / 血液型ルイス抗原 / ポリラクトサミン / 抗腫瘍活性 / CD26 |
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| 研究概要 |
マンナン結合タンパク質(mannan-binding protein ; MBP)はマンノース、N-アセチルグルコサミン、フコースに特異的な、血清中のCa^<2+>依存性レクチンである。MBPはヒト結腸癌由来SW1116細胞に対し、増殖抑制作用をもつ。これまで報告者らはこの抗腫瘍活性に関与すると考えられる、癌細胞上に発現する、内在性MBPリガンドオリゴ糖鎖の単離に成功し、それらがルイスAのタンデムリピートをもち、非常に特徴的な構造をもつフコースに富んだ長鎖のポリラクトサミン様糖鎖であることを明らかにした。本研究では、SW1116細胞に発現する、この新規のN-グリコシド型MBPリガンドオリゴ糖鎖を担う、癌細胞上の糖タンパク質を単離同定し、この糖タンパク質のどの部位に特徴的な構造をもつ糖鎖が結合しているかをグリコプロテオミクスの手法により明らかにした。
1)SW1116細胞の膜画分からMBPリガンド糖タンパク質の単離と同定を行った。
大量培養したSW1116細胞から調製した膜画分を、AALカラム、抗ルイスbモノクロール抗体カラム、MBPカラムにかけ、MBPリガンド糖タンパク質(MLGP)を調製した。MLGPのうち、主要な120kDaを示すタンパク質は、質量分析によるプロテオーム解析により、CD26分子であることが明らかとなった。
2)MLGP画分より抗ヒトCD26モノクロール抗体カラムを用いて、CD26を単離精製した。
3)CD26の糖鎖付加部位を質量分析により同定した。
単離精製したCD26をキモトリプシン消化し、MBPカラムにより、MBP結合画分と非結合画分に分画した。それぞれの画分をN-グリカナーゼ消化後、ペプチド部分と糖鎖部分に分離した。ペプチド部分の質量分析により、糖鎖付加部位の同定を行ったところ、9カ所の潜在的N-グリコシド型糖鎖付加部位のうち、7箇所を明らかにすることができた。また、糖鎖画分の質量分析により、CD26分子に、特徴的なMBPリガンド糖鎖が載っていることがわかった。
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